Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione

Summary

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Abstract

Poiché la microscopia elettronica a trasmissione 1940 (TEM) ha fornito i biologi con immagini ultra-alta risoluzione di materiali biologici. Tuttavia, a causa dei protocolli laboriose e lunghe che richiedono anche esperienza nella preparazione dei campioni prive di artefatti, TEM non è considerata una tecnica di facile utilizzo. Preparazione del campione Tradizionale per TEM usato fissativi chimici per preservare le strutture cellulari. Di congelamento ad alta pressione è il cryofixation di campioni biologici sotto alte pressioni per produrre velocità di raffreddamento molto rapidi, limitando in tal modo la formazione di ghiaccio, che è dannoso per l'integrità della ultrastruttura cellulare. Di congelamento ad alta pressione e la sostituzione congelamento sono attualmente i metodi di scelta per produrre la morfologia più alta qualità nelle sezioni in resina per TEM. Questi metodi minimizzano i manufatti normalmente connessi con l'elaborazione convenzionale per TEM di sezioni sottili. Dopo cryofixation l'acqua congelata nel campione viene sostituito con il liquidosolvente organico a basse temperature, un processo chiamato sostituzione congelamento. Sostituzione di Fermo è tipicamente effettuata per diversi giorni in dedicati, attrezzature costose. Una recente innovazione permette il processo per essere completato in tre ore, invece dei soliti due giorni. Questo è in genere seguito da diversi giorni di preparazione del campione, che comprende l'infiltrazione e l'inclusione in resine epossidiche prima del sezionamento. Qui vi presentiamo un protocollo che combina il congelamento ad alta pressione e la sostituzione di congelamento rapido che consente la fissazione del campione pianta per essere realizzato in poche ore. Il protocollo può essere facilmente adattato per lavorare con altri tessuti o organismi. Tessuti vegetali sono di particolare interesse per la presenza di spazi aerati e vacuoli pieni d'acqua che impediscono il congelamento senza ghiaccio d'acqua. Inoltre, il processo di sintesi chimica è particolarmente lunghi in piante dovuto a pareti cellulari che impediscono la penetrazione delle sostanze chimiche di profondità all'interno dei tessuti. Tessuti vegetali sono quindi particlarmente impegnativo, ma questo protocollo è affidabile e produce campioni di altissima qualità.

Introduction

La nostra conoscenza della ultrastruttura cellulare proviene principalmente da microscopia elettronica, che possono risolvere dettagli nell'intervallo di pochi nanometri ^1. Pur essendo così potente nella risoluzione TEM non è considerato user-friendly, come la preparazione del campione richiede tempo e protocolli laboriosi, e richiede una certa esperienza da professionista. Fissazione tradizionale dei campioni ha combinato l'uso di aldeidi e tetrossido di osmio prima di ulteriori trasformazioni che comprende la disidratazione, inclusione in resina e poi sezionamento per la produzione di sezioni ultrasottili che vengono poi colorate con metalli pesanti. Tuttavia, è noto che la fissazione chimica può produrre artefatti compresi aggregazione proteica e la perdita di lipidi ^1, e modifiche alle membrane che influenzano in definitiva più compartimenti cellulari ^2. Questi manufatti sono in gran parte attribuite al basso tasso di fissazione e disidratazione a temperatura ambiente ^{3, 4, 5.}

<p class="Jove_content"> Cryofixation da alta pressione congelamento (HPF) evita la maggior parte degli artefatti causati dalla fissazione chimica. Il principio di cryofixation è che abbassa il punto di congelamento dell'acqua di 20 gradi, rallenta la nucleazione e la crescita dei cristalli di ghiaccio e aumenta la viscosità dell'acqua in un campione biologico in modo che costituenti cellulari sono essenzialmente immobilizzati ^{6, 7.} HPF diminuisce un temperatura del campione a quella dell'azoto liquido, sotto pressione molto elevata (210 MPa o 2.100 bar) in millisecondi. Quando fatto correttamente HPF impedisce la formazione di grossi cristalli di ghiaccio che possono causare gravi danni alla ultrastruttura delle cellule. HPF può essere utilizzato per fissare i campioni di 100-200 micron di spessore a concentrazioni tipiche di soluti biologici ^7. Ci sono numerose recensioni sulla fisica ei principi di base HPF, ad ^{esempio, 1, 7, 8.}

Dopo HPF, i campioni vengono incubati a bassa temperatura (-78,5 ° C a -90 &# 176, C) in presenza di solventi contenenti fissativi chimici liquidi organici come tetrossido di osmio, generalmente per un paio di giorni. A questa bassa temperatura, l'acqua del campione è sostituito dal solvente organico, tipicamente acetone o metanolo ^{1, 9.} Pertanto, questo processo è chiamato sostituzione congelamento (FS). Il campione viene poi gradualmente riscaldato e durante questo tempo è fisso, di solito con tetrossido di osmio e acetato di uranile ^9. Reticolazione a bassa temperatura ha il vantaggio di fissare molecole che sono immobilizzati ^1. FS produce pertanto campioni di qualità superiore rispetto a quelli fissati dalla fissazione chimica convenzionale a temperatura ambiente, in particolare si traduce in una migliore conservazione ultrastrutturale, migliore conservazione di antigenicità e ridotta perdita di componenti cellulari non legati ^{10, 11.}

La maggior parte delle FS viene effettuata su periodi di tempo lunghi, in genere fino a diversi giorni. Ciò è particolarmente true per le piante campioni ^{12, 13, 14.} Un protocollo recente sviluppato da McDonald e Webb riduce notevolmente il tempo di FS da diversi giorni a poche ore ^15. Nella procedura loro rapida sostituzione congelamento (QFS), FS viene effettuata più di 3 ore, mentre nelle FS super veloce (SQFS) campioni vengono processati in 90 minuti. La qualità dei campioni prodotti da questi metodi è paragonabile a quelli derivanti dai protocolli FS tradizionali. Abbiamo adottato il protocollo QFS per la lavorazione a valle di campioni vegetali dopo HPF. Questo ha dimostrato di risparmiare non solo tempo ma anche denaro, come QFS e SQFS utilizzano apparecchiature di laboratorio comune al posto delle macchine FS disponibili in commercio costosi.

Tessuti vegetali sono spesso molto impegnativo per preparare TEM. In media, le cellule vegetali sono più grandi di quanto sia cellule batteriche o animali. La presenza di idrofobica cuticola cerosa, pareti cellulari spesse, grandi vacuoli pieni d'acqua contenenti acidi organici, idrolasi e fenolica compounds che possono occupare fino al 90% del volume cellulare totale ^16, e la presenza di spazi aerati diminuisce notevolmente la conducibilità termica del sistema ^17. Inoltre, nel caso di impianti, lo spessore del campione supera quasi sempre 20 micron, il limite per l'uso di fissaggio chimico. A questi spessori, la bassa conducibilità termica di acqua impedisce una velocità di congelamento più di -10.000 ° C / sec al centro del campione. Questo tasso è necessaria per evitare la formazione di ghiaccio danneggiare esagonale (cristalli di ghiaccio con una densità più bassa e più grande di 10 a 15 nm) ^8. Insieme, questi presentano sfide sia corretto congelamento del campione e FS successive. Tuttavia, cryofixation è il metodo migliore per il fissaggio campioni vegetali. Qui un protocollo per HPF-QFS di campioni di tessuto vegetale è presentato. Si concentra sul modello di specie Arabidopsis thaliana, ma è stato utilizzato anche con Nicotiana benthamiana. I risultati tipici dimostrano che HPF-QFS produce samples di qualità paragonabile a tradizionali HPF-FS in una frazione del tempo. Con aggiustamenti, questo protocollo può essere utilizzato anche per altri campioni biologici relativamente spessi.

Protocol

NOTA: La procedura QFS richiede estrema attenzione e cautela da parte dell'utente e che evidenziare queste precauzioni di sicurezza qui come attenzione e note ove applicabili. 1.Preparazione per HPF Run Prima di iniziare la preparazione del campione, accendere il congelatore ad alta pressione seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: L'unità HPF utilizzata in questo protocollo è una unità compatta Wohlwend 02 (Figura 1A), e ci vuole circa un a…

Representative Results

I risultati presentati di seguito sono stati ottenuti utilizzando un Wohlwend Compact 02 per HPF (Figura 1A). Uno dei principali vantaggi di questo strumento è la facilità di utilizzo dei vettori dei campioni e dei suoi titolari. Quando si utilizzano altri strumenti, McDonald raccomanda che due utenti devono effettuare la preparazione del campione e HPF, una preparazione dei campioni, mentre l'altro fa il congelamento e trasferimento FS cryovials 9. Tuttavia, il Wohlwend provino vettori…

Discussion

Il successo del protocollo presentato qui dipende molto l'utente. In primo luogo, una preparazione avanzata è necessaria per garantire che tutti i materiali necessari sono facilmente disponibili e in quantità sufficiente per completare un intero run HPF-QFS. In secondo luogo, l'utente deve lavorare velocemente, passando da passo-a-passo in modo efficiente che minimizza la manipolazione del campione, riducendo così al minimo i cambiamenti allo stato nativo del tessuto. Una volta che i campioni sono congelati e…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch – Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 mL	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs