Tandem Högtrycks Frysning och Quick Freeze Substitution av växtvävnad för transmissionselektronmikroskopi

Summary

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Abstract

Sedan 1940-talet transmissionselektronmikroskop (TEM) har försett biologer med extremt högupplösta bilder av biologiska material. Men på grund av mödosamma och tidskrävande protokoll som även kräver erfarenhet av beredning av artefaktfria prover, TEM anses inte vara en användarvänlig teknik. Traditionell provberedning för TEM använt kemiska fixeringsmedel för att bevara cellstrukturer. Högtrycks frysning är cryofixation av biologiska prover under höga tryck för att producera mycket snabba kylningshastigheter, och därmed begränsar isbildning, vilket är till skada för integriteten i cellultra. Högtrycks frysning och fryssubstitution är för närvarande de metoder för val för att producera högsta kvalitet morfologi i sektioner för TEM harts. Dessa metoder minimera artefakter som normalt förknippas med konventionell behandling för TEM i tunna sektioner. Efter cryofixation det frusna vattnet i provet skall ersättas med vätskaorganiskt lösningsmedel vid låga temperaturer, en process som kallas fryssubstitution. Freeze substitution utförs vanligtvis under flera dagar i hängiven, dyrbar utrustning. En ny innovation gör processen vara klar i tre timmar, i stället för de vanliga två dagarna. Detta är vanligtvis följs av ytterligare flera dagars provberedning som innehåller infiltration och inbäddning i epoxihartser innan snittning. Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar högtrycksfrysning och snabb frysa substitution som gör att växtprovet fixering bli genomförda inom timmar. Protokollet kan lätt anpassas för att arbeta med andra vävnader eller organismer. Växtvävnader är ett särskilt problem på grund av förekomsten av kolsyrat utrymmen och vattenfyllda vakuoler som hindrar isfritt frysning av vatten. Dessutom är processen för kemisk fixering särskilt länge i växter på grund av cellväggar som hindrar penetrering av kemikalierna till djupt i vävnaderna. Växtvävnader är därför particbundet utmanande, men detta protokoll är tillförlitlig och ger prov på högsta kvalitet.

Introduction

Vår kunskap om cellultra kommer främst från elektronmikroskopi, vilket kan lösa uppgifter i intervallet några nanometer ^1. Trots att så kraftfull i upplösning TEM anses inte vara användarvänligt, som provberedning kräver tidskrävande och mödosamma protokoll, och kräver viss expertis från utövaren. Traditionell fixering av prover har kombinerat användningen av aldehyder och osmiumtetroxid innan vidare behandling som inkluderar uttorkning, ingjutning i plast och sedan sektione producera ultratunna sektioner som sedan färgas med tungmetaller. Det är dock känt att kemisk fixering kan producera artefakter inklusive proteinaggregering och förlust av lipider ^1, och förändringar till membran som i slutändan drabbar flera cellulära fack ^2. Dessa artefakter är till stor del hänföras till den långsamma hastigheten för fixering och dehydratisering vid rumstemperatur ^{3, 4, 5.}

<p class="Jove_content"> Cryofixation genom högtrycksfrysning (HPF) undviker de flesta av de artefakter som orsakas av kemisk fixering. Principen för cryofixation är att det sänker fryspunkten för vatten vid 20 grader, saktar ner kärnbildning och tillväxt av iskristaller och ökar viskositeten hos vatten i ett biologiskt prov, så att cellulära beståndsdelar är väsentligen immobiliserad ^{6, 7.} HPF minskar en provets temperatur till det av flytande kväve, under mycket högt tryck (210 MPa eller 2.100 bar) i millisekunder. När den görs rätt HPF förhindrar bildning av stora iskristaller som kan orsaka stora skador på cellultra. HPF kan användas för att fixera prover av 100-200 um tjocklek vid typiska koncentrationer av biologiska lösta ämnen ^7. Det finns många recensioner på fysik och principer som ligger till grund HPF, t.ex. ^{1, 7, 8.}

Efter HPF tas prover inkuberas vid låg temperatur (-78,5 ° C till -90 &# 176; C) i närvaro av flytande organiska lösningsmedel som innehåller kemiska fixeringsmedel som osmiumtetroxid, vanligtvis för ett par dagar. Vid denna låga temperatur, är vattnet i provet ersättas med organiskt lösningsmedel, typiskt aceton eller metanol ^{1, 9.} Således är denna process som kallas fryssubstitution (FS). Provet sedan gradvis värms och under denna tid är fast, oftast med osmiumtetroxid och uranylacetat ^9. Tvärbindning vid låga temperaturer har fördelen att fastställande molekyler som är immobiliserade ^1. FS därför producerar prover av överlägsen kvalitet jämfört med dem som fastställs genom konventionell kemisk fixering vid rumstemperatur, särskilt det resulterar i förbättrad ultra konservering, bättre bevarande av antigenicitet och minskad förlust av obundna cellulära komponenter ^{10, 11.}

De flesta FS genomföres under långa tidsperioder, typiskt upp till flera dagar. Detta är särskilt true Växter proverna ^{12, 13, 14.} En nyligen protokoll utvecklat av McDonald och Webb reducerar kraftigt tiden för FS från några dagar till några timmar ^15. I sin snabbt förfarande fryssubstitution (QFS), är FS genomförs under 3 timmar, medan de supersnabba FS (SQFS) prover behandlas i 90 minuter. Kvaliteten på prover som produceras av dessa metoder är jämförbara med de som genereras av traditionella FS-protokoll. Vi har antagit QFS protokoll för efterföljande bearbetning av växtprover efter HPF. Detta har visat sig spara inte bara tid utan också pengar, som QFS och SQFS använder vanliga laboratorieutrustning i stället för de dyra kommersiellt tillgängliga FS maskiner.

Växt vävnader är ofta mycket svårt att förbereda sig för TEM. I genomsnitt växtceller är större än både bakteriella eller djurceller. Närvaron av hydrofoba vaxartad nagelband, tjocka cellväggar, stora vattenfyllda vakuoler som innehåller organiska syror, hydrolaser och fenol compounds som kan uppta upp till 90% av den totala cellvolymen ^16, och närvaron av kolsyrat utrymmen allvarligt minskar värmeledningsförmågan hos systemet ^17. Vidare när det gäller växter, provets tjocklek överstiger nästan alltid 20 pm, gränsen för användning av kemisk fixering. Vid dessa tjocklekar, den låga värmeledningsförmågan hos vattnet förhindrar en fryshastigheten mer än -10.000 ° C / sek i centrum av provet. Denna kurs krävs för att undvika skadlig hexagonal isbildning (iskristaller med lägre densitet och större än 10 till 15 nm) ^8. Tillsammans utgör dessa innebär utmaningar för både ordentlig frysning av provet och efterföljande FS. Ändå är cryofixation den bästa metoden för att fastställa växtprover. Här ett protokoll för HPF-QFS av växtvävnadsprover presenteras. Den fokuserar på modell arter Arabidopsis thaliana, men har också använts med Nicotiana benthamiana. De typiska resultat visar att HPF-QFS producerar samples av jämförbar kvalitet med traditionella HPF-FS på en bråkdel av tiden. Med lämpliga justeringar, kan detta protokoll också kan användas för andra relativt tjocka biologiska prover.

Protocol

OBS! QFS proceduren kräver extrem försiktighet och försiktighet av användaren och vi lyfta fram dessa säkerhetsåtgärder här som försiktig och Obs förekommande fall. 1.Preparation för HPF Run Innan provberedning, slå på högtrycks frys efter tillverkarens instruktioner. OBS! HPF enhet som används i detta protokoll är en Wohlwend Compact 02 enhet (figur 1 A), och det tar cirka ett till ett och en halv timme av startproceduren innan HPF körs ka…

Representative Results

Resultat som presenteras nedan har erhållits med en Wohlwend Compact 02 för HPF (Figur 1A). En stor fördel med detta instrument är lätt att använda av proven bärare och dess innehavare. Vid användning av andra instrument, rekommenderar McDonald att två användare bör utföra förberedelserna och HPF, ett prov förbereder proven medan den andra gör frysning och transfer till FS cryovials 9. Men Wohlwend prov bärare och hållare är tillräckligt enkelt för en användare att manipu…

Discussion

Framgången för det protokoll som presenteras här beror mycket på användaren. Först avancerade förberedelser som krävs för att säkerställa att alla nödvändiga material är lätt tillgängliga och i tillräcklig mängd för att fylla en hel HPF-QFS sikt. För det andra måste användaren arbeta snabbt, flytta från steg-för-steg på ett effektivt sätt som minimerar provhantering, vilket minimerar ändringar i det nativa tillståndet av vävnaden. När proverna fryses och innan de är uttorkad är det viktig…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch – Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 mL	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs