This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.
पौधों और हरी शैवाल में, प्रकाश प्रकाश कटाई परिसरों (LHCs), chlorophylls और कैरोटीनॉयड समन्वय कि अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के एक परिवार ने कब्जा कर लिया है. में विवो, इन प्रोटीनों thylakoid झिल्ली में डाला जाता है जो परिसरों के लिए फार्म पिगमेंट के साथ जोड़ रहे हैं क्लोरोप्लास्ट की. साथ में वे आसानी से अलगाव के दौरान पिगमेंट खो सकते हैं कि इस तथ्य के साथ परिवार के सदस्यों के रासायनिक और भौतिक गुणों में उच्च समानता, एक देशी राज्य में उनकी शुद्धि चुनौतीपूर्ण बना देता है. LHCs के सजातीय तैयारी प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण यह देशी की है कि इसी तरह के गुणों के साथ परिसरों में जिसके परिणामस्वरूप, शुद्ध पिगमेंट और सामने आया apoproteins से शुरू विट्रो में इन परिसरों पुनर्गठित करने के लिए संभव था कि पता चला है, जो 1987 में 1 Plumley और श्मिट द्वारा विकसित किया गया था परिसरों. यह इन विट्रो के लिए जीवाणु व्यक्त पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग करने के लिए रास्ता खोला </eM> पुनर्गठन. पुनर्गठन विधि विभिन्न कारणों के लिए शक्तिशाली है: (1) व्यक्तिगत परिसरों का शुद्ध तैयारी प्राप्त किया जा सकता है, (2) वर्णक रचना संरचना और समारोह के लिए उनके योगदान का आकलन करने के लिए नियंत्रित किया जा सकता है, (3) पुनः संयोजक प्रोटीन कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए उत्परिवर्तित किया जा सकता है व्यक्तिगत अवशेषों (जैसे, वर्णक बाध्यकारी साइटों) या प्रोटीन डोमेन (जैसे, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, तह) की भूमिका. यह विधि कई प्रयोगशालाओं में अनुकूलित और प्रकाश कटाई परिसरों की सबसे करने के लिए लागू किया गया है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल, वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता विट्रो में प्रकाश कटाई परिसरों पुनर्गठन की विधि का विवरण और विधि के आवेदन का वर्णन उदाहरण प्रदान की जाती हैं.
पौधों और शैवाल का संश्लेषक तंत्र अभिन्न झिल्ली (सीएचएल एक) क्लोरोफिल एक बाँध कि प्रोटीन, बी (सीएचएल ख) और कैरोटीनॉयड (कार) शामिल हैं. ये वर्णक प्रोटीन परिसरों कटाई प्रकाश ऊर्जा और यह आरोप जुदाई 2 को बढ़ावा देने के लिए किया जाता है जहां प्रतिक्रिया केन्द्रों तक कि उत्तेजना ऊर्जा में परिवर्तित करने में सक्रिय हैं. उन्होंने यह भी उच्च प्रकाश क्षति 3,4 से संश्लेषक तंत्र की रक्षा है कि नियामक प्रतिक्रिया तंत्र में शामिल किया जाता है. प्रकाश कटाई परिसरों (LHCs) पौधों और शैवाल 5 में संबंधित प्रोटीन के एक बड़े परिवार के शामिल हैं.
परिवार के प्रत्येक सदस्य के सजातीय शुद्धि परिसरों की अत्यधिक समान रासायनिक और भौतिक गुणों से जटिल कर दिया गया है. इसके अलावा, शोधन प्रक्रियाओं अक्सर ऐसे लिपिड के रूप में पिगमेंट या अन्य संभावित सहकारकों की हानि में परिणाम. इन विट्रो पुनर्गठन प्रतिनिधिटीएस एक शक्तिशाली तरीका इन समस्याओं को दूर करने के लिए. द्वितीय Photosystem (LHC II) के साथ जुड़े LHC पहले शोधकर्ताओं संयंत्र क्लोरोप्लास्ट से अलग delipidated प्रोटीन और pigments निकाले. 1987 1 में Plumley और श्मिट ने इन विट्रो में पुनर्गठन किया है, और फिर लिथियम की उपस्थिति में पिगमेंट के साथ गर्मी विकृत प्रोटीन जोड़ दिया गया था ठंड और विगलन 1 के तीन चक्रों के बाद dodecyl सल्फेट (एलडीएस),. वे पुनर्गठन LHC परिसरों के वर्णक्रम गुण पौधों से शुद्ध परिसरों के लिए बहुत समान थे कि पता चला है. जीवों से शुद्ध परिसरों को अलग करने में कठिनाई के साथ, कारण कुछ निहित आत्म विधानसभा की सुविधा के लिए LHC वर्णक प्रोटीन परिसरों, संभावना पुनर्गठन की आसानी, अन्य शोधकर्ताओं द्वारा विधि के त्वरित गोद लेने के लिए नेतृत्व किया. Escherichia कोलाई (ई कोलाई) में overexpressed संश्लेषक प्रोटीन का पुनर्गठन 1990 6 में Paulsen और उनके सहयोगियों द्वारा प्राप्त किया गया था. ई मेंकोलाई, overexpressed झिल्ली प्रोटीन आम तौर पर शामिल किए जाने के शरीर में निहित हैं जो सुविधाओं उनकी शुद्धि. पुनर्गठन प्रोटीन तह शुरू की जो pigments के अलावा द्वारा पीछा LDS की उपस्थिति में पुनः संयोजक प्रोटीन युक्त समावेश निकायों की गर्मी विकृतीकरण के माध्यम से हासिल की है. LHCII परिसर की तह एक दो कदम प्रक्रिया है: पहला, क्लोरोफिल एक कम से कम 1 मिनट में ही है; दूसरा, क्लोरोफिल बी कई मिनट पर 7 बाध्य और स्थिर है.
तह गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के अलावा, साइट निर्देशित mutagenesis के साथ संयुक्त विट्रो पुनर्गठन में विशिष्ट एमिनो स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण एसिड (जैसे, 8,9) या वर्णक समन्वय की पहचान की अनुमति दी है (उदाहरण के लिए, 10). ऐसे वर्णक रचना या डिटर्जेंट के रूप में मानकों का समायोजन करके शर्तों refolding का हेरफेर भी तत्वों के महत्वपूर्ण पहचान की हैऐसे LHCII जटिल के लिए Xanthophylls की आवश्यकता के रूप में उचित तह, एल (जैसे, 1,11). इसके अलावा, परिसरों के लिए बाध्य व्यक्तिगत पिगमेंट की संपत्तियों की जांच विवो में पुनर्गठित परिसरों का उपयोग संभव हो गया है (उदाहरण के लिए, 10).
यहाँ वर्णित विधि pigments के अलगाव (chlorophylls और कैरोटीनॉयड) पालक से और हरी शैवाल Chlamydomonas reinhardtii के साथ शुरू होता है. ई से एक LHC प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि शामिल किए जाने के शव के रूप में कोलाई तो नी आत्मीयता स्तंभ द्वारा LHC के पुनर्गठन और बाद शुद्धि के बाद, विस्तृत है. अंतिम चरण में, पुनर्गठन परिसरों आगे मुक्त पिगमेंट और सामने आया apoprotein दूर करने के लिए sucrose ढाल centrifugation द्वारा शुद्ध कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल से अधिक विभिन्न प्रयोगशालाओं द्वारा पेश किया गया है कि कई संशोधनों को शामिल एक अनुकूलित प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता हैसमय 1,6,10,12 -14.
झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इतना आसान नहीं हैं. देशी झिल्ली प्रोटीन के अलगाव प्रोटीन को नुकसान पहुंचा और आवश्यक सहकारकों हटा सकते हैं जो डिटर्जेंट के साथ लिपिड bilayer solubilize करने की जरूरत है, से जटिल है. ये प्रोटीन भी जैविक झिल्लियों में निम्न स्तर पर उपस्थित हो सकता है, या मुश्किल एकल परिसरों की शुद्धि करता है कि प्रकाश कटाई परिसरों के मामले में के रूप में, निकट से संबंधित प्रोटीन के साथ मिश्रित किया. ई में heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति कोलाई और इन विट्रो पुनर्गठन में इन समस्याओं से बचने के लिए संभावना प्रदान करता है. इन विट्रो एकरूपता 24 को शुद्ध नहीं किया जा सकता कि परिसरों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता देशी परिसरों 20,21,23 और इस तरह के लोगों को बहुत ही लक्षण अधिकारी परिसरों में पुनर्गठन और मुड़ा हुआ प्रोटीन परिणामों की शुद्धि – 27.
इस विधि attainab आसानी से जो पालक, का उपयोग करता हैकुल वर्णक और कैरोटीनॉयड की तैयारी के लिए एक स्रोत के रूप में ले वर्ष दौर,. शैवाल के लिए देशी प्रोटीन के कुछ reconstitutions के लिए, शैवाल से शुद्ध पिगमेंट के उपयोग के कारण अलग रंग रचनाओं को पसंद किया जाता है. Chl ए / बी अनुपात और Chl / कार अनुपात की परवाह किए बिना वर्णक स्रोत का ही रहता है.
यह पुनर्गठन की दक्षता आमतौर पर लगभग 35% से 28 का एहसास है कि महत्वपूर्ण है. इस प्रकार यह पुनर्गठन के बाद समाधान से गैर बाध्य pigments और सामने आया apoprotein दूर करने के लिए आवश्यक है. एक दो कदम शुद्धि प्रोटोकॉल (भी परिणाम देखें) इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया है. हालांकि, यह सूक्रोज ढाल कदम apo- और Holo प्रोटीन की पूरी जुदाई की अनुमति नहीं है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. Apoprotein कार्यात्मक माप के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, इस प्रकार पिगमेंट होते हैं और यह नहीं है के रूप में सबसे विश्लेषण के लिए यह एक समस्या नहीं है. हालांकि, मामले में यह पूरी तरह से fr से apoprotein दूर करने के लिए आवश्यक हैपुनर्गठन जटिल (उदाहरण के लिए, प्रोटीन stoichiometry को वर्णक गणना करने के लिए) युक्त कार्रवाई, एक anionic विनिमय स्तंभ (देखें Passarini एट अल. विवरण के लिए 2009 29) का उपयोग किया जा सकता है.
क्षमता इन विट्रो में पृथक पिगमेंट के साथ पुनः संयोजक प्रकाश कटाई प्रोटीन refold जिससे परिणामस्वरूप परिसर की विशेषताओं में परिवर्तन, विभिन्न तरीकों से पुनर्गठन "पर्यावरण" संशोधित करके परिसरों "हेरफेर" के लिए एक अवसर प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, पुनर्गठन के दौरान रंग संरचना को बदलने बदल वर्णक संरचना के साथ एक जटिल में परिणाम कर सकते हैं. यह सुविधा विभिन्न रंजकों परिसर की संरचना और स्थिरता पर है प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. 1 और 2.9 का एक Chl / कार अनुपात: आमतौर पर पालक से प्राप्त वर्णक तैयारी 3 के एक Chl ए / बी अनुपात है 1. इस अनुपात आम तौर पर एन के रूप में एक ही गुण के साथ एक पुनर्गठन प्रोटीन का उत्पादनएक ative. 33 – हालांकि, शुद्ध Chl एक या बी के अलावा द्वारा Chl ए / बी अनुपात के समायोजन बाध्यकारी साइटों 30 के चयनात्मकता अलग होने के कारण विभिन्न रंजकों के बंधन को प्रभावित कर सकते हैं. वर्णक बाध्यकारी साइटों की सबसे Chl एक या Chl बी के लिए पूरी तरह से चयनात्मक नहीं कर रहे हैं, लेकिन दोनों को समायोजित कर सकते हैं, क्योंकि यह संभव है, हालांकि अलग आत्मीयता 10,30,34 के साथ. 38 – एक समान तरीके में, कैरोटीनॉयड बाध्यकारी साइटों को भी एक से अधिक Xanthophyll प्रजातियों 8,35 पूरा करने में सक्षम होना दिखाया गया. CP26, विभिन्न रंग रचनाओं का उपयोग उच्च पौधों की एक और वर्णक प्रोटीन परिसर के विभिन्न reconstitutions तालिका 2 39 में दिखाए जाते हैं. ये reconstitutions विशेष पिगमेंट 39 के लिए बाध्यकारी साइटों की आत्मीयता का आकलन किया गया. यह एक ही रंग ग के साथ एक जटिल प्राप्त करने के लिए है कि दिलचस्प है ध्यान दें1: देशी रूप omposition, रंग मिश्रण के Chl ए / बी अनुपात 3 होना चाहिए. इस उच्च पौधों 20,40 के सभी LHC परिसरों के लिए मामला प्रतीत हो रहा है.
पुनर्गठन तकनीक के साथ आणविक जीव विज्ञान के संयोजन एक Chl बाध्यकारी परिसर के गुण अधिक विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है. 44 – परिसरों, या प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में उनकी भागीदारी की स्थिरता और तह पर विभिन्न प्रोटीन डोमेन के महत्व, apoprotein छोटा या यादृच्छिक mutagenesis 8,41 प्रदर्शन द्वारा निर्धारित किया गया है. 52 – अलग pigments के समन्वय के लिए महत्वपूर्ण एकल एमिनो एसिड के अवशेष व्यक्ति पिगमेंट के गुणों का विश्लेषण या जटिल 10,28,29,45 के समारोह और स्थिरता के लिए उनके योगदान का आकलन करने के क्रम में साइट निर्देशित mutagenesis के माध्यम से बदला जा सकता है. चित्रा 6 शो के साथ Lhcb4 (CP29) का पुनर्गठनस्थिति 216 53 पर हिस्टिडीन की एक उत्परिवर्तन. wildtype और उत्परिवर्ती परिसरों के रंग संरचना की तुलना उत्परिवर्तन लक्षित साइट गुम्मट परिसर में एक Chl एक accommodates यह दर्शाता है कि एक अणु एक Chl के नुकसान लाती है कि पता चलता है. WT और उत्परिवर्ती का अवशोषण स्पेक्ट्रा के मतभेद, वर्णक सामग्री को सामान्य बनाने पर, भी खो वर्णक के अवशोषण गुण को दर्शाता है. इस मामले में, अंतर Chl His216 द्वारा समन्वित एक इस तरंग दैर्ध्य में अवशोषित (इस उत्परिवर्ती के बारे में अधिक जानकारी के लिए और स्पेक्ट्रोस्कोपी गुण MOZZO एट अल. 2008 53 देखें) यह दर्शाता है कि 680 एनएम पर मुख्य शिखर में देखा जा सकता है. म्यूटेशन विश्लेषण भी पिगमेंट 54 के स्पेक्ट्रोस्कोपी गुणों पर पर्यावरण के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
अंत में, प्रकाश कटाई प्रोटीन आसानी से वर्णक-protei में जिसके परिणामस्वरूप इन विट्रो में पुनर्गठन किया जा सकता हैदेशी परिसरों के लिए बहुत इसी तरह की संपत्ति के साथ n परिसरों. भी आगे के अध्ययन के लिए उच्च उपज और पवित्रता के साथ प्रोटीन तैयारी देते हुए इस तरह, देशी प्रोटीन को अलग करने की कठिनाइयों, समाप्त हो जाते हैं. एक 3 का महत्व: एक प्रामाणिक जटिल उत्पादन में 1 Chl ए / बी अनुपात पर बल दिया है, और पुनर्गठन wildtype और उत्परिवर्ती LHCs के उदाहरण तकनीक के आवेदन को वर्णन करने के लिए प्रदान की जाती हैं.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
Nylon cloth | 20 μm pores | ||
Soft artists paint brush | |||
NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
Beta-DM | Sigma | D4641 | |
DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
Milk Powders | |||
RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
Sonicator | |||
Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
TAP medium | see reference 17 | ||
LB medium | see reference 19 |