This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.
I planter og grønne alger, er lys fanget af lys-høst komplekser (LHCs), en familie af integrale membranproteiner, der koordinerer chlorophyler og carotenoider. In vivo er disse proteiner foldes med pigmenter til at danne komplekser, der er indsat i thylakoid membran af kloroplast. Den høje lighed i de kemiske og fysiske egenskaber af medlemmer af familien, sammen med det faktum, at de nemt kan miste pigmenter under isolering, der gør deres oprensning i en indfødt tilstand udfordrende. En alternativ fremgangsmåde til at opnå homogene præparater af LHCs blev udviklet af Plumley og Schmidt i 1987 1, som viste, at det var muligt at rekonstruere disse komplekser in vitro begyndende fra oprensede pigmenter og ufoldede apoproteiner, hvilket resulterer i komplekser med egenskaber meget lig den for nativ komplekser. Dette åbnede vejen for anvendelsen af bakterielle udtrykte rekombinante proteiner til in vitro </em> rekonstituering. Rekonstitutionstiden metode er stærk forskellige årsager: (1) kan opnås rene præparater af de individuelle komplekser, (2) pigmentsammensætning kan styres til at vurdere deres bidrag til struktur og funktion, (3) rekombinante proteiner kan muteres til at undersøge den funktionelle rolle af de enkelte rester (f.eks pigment bindende sites) eller proteindomæne (f.eks, protein-protein-interaktion, foldning). Denne metode er blevet optimeret i flere laboratorier og anvendes til de fleste af lys-høst komplekser. Den her beskrevne protokol detaljer metoden til rekonstituering lys-høst komplekser in vitro i øjeblikket anvendes i vores laboratorium, og eksempler beskriver anvendelser af fremgangsmåden er tilvejebragt.
Den fotosyntetiske apparat af planter og alger omfatter integrerede membranproteiner, som binder klorofyl a (CHL a), b (CHL b) og carotenoider (bil). Disse pigment-protein-komplekser er aktive i høst lysenergi og overføre denne excitationsenergi til reaktionen centre, hvor det bruges til at fremme ladningsadskillelse 2. De er også involveret i regulatoriske feedback-mekanismer, der beskytter den fotosyntetiske apparat af høj lys skader 3,4. De lys høst komplekser (LHCs) består af en stor familie af beslægtede proteiner i planter og alger 5.
Den homogene oprensning af hvert medlem af familien har været kompliceret af den meget lignende kemiske og fysiske egenskaber af komplekserne. Desuden oprensningsprocedurer ofte resultere i tab af pigmenter eller andre potentielle cofaktorer såsom lipider. In vitro rekonstitution repræsents en kraftfuld metode til at overvinde disse problemer. LHC forbundet med fotosystem II (LHC-II) blev først rekonstitueret in vitro med Plumley og Schmidt i 1987 1. Forskerne ekstraheret delipiderede protein og pigmenter adskilt fra vegetabilske chloroplaster, og derefter kombineret varmedenatureret protein med pigmenter i nærværelse af lithium sulfat (LDS), efterfulgt af tre cyklusser af frysning og optøning 1. De viste, at de spektrale egenskaber af den opløste LHC komplekser var meget lig komplekser oprenset fra planter. Den lethed rekonstituering LHC pigment-protein-komplekser, sandsynligvis på grund af nogle iboende selv-samling, indgår sammen med vanskeligheden ved at isolere oprensede komplekser fra organismer, førte til en hurtig vedtagelse af metoden af andre forskere. Rekonstituering af fotosyntetiske proteiner overudtrykt i Escherichia coli (E. coli) blev opnået ved Paulsen og hans kolleger i 1990 6. I E.coli, overudtrykt membranproteiner typisk er indeholdt i inklusionslegemer, som faciliteter deres rensning. Rekonstituering opnås ved varmedenaturering af inklusionslegemer indeholdende det rekombinante protein i nærvær af SDH, efterfulgt af tilsætning af pigmenter, som initierer proteinfoldning. Foldning af LHCII komplekset er en to-trins proces: det første er klorofyl bundet i mindre end 1 min; sekund, klorofyl B bundet og stabiliseret over adskillige minutter 7.
Ud over at give indsigt i de folde dynamik, har in vitro rekonstitution kombineret med mutagenese tillod identifikation af specifikke aminosyrer er vigtige for stabilitet (fx 8,9) eller pigmenter koordination (fx 10). Manipulation af genfoldningsbetingelser ved at justere parametre såsom pigment sammensætning eller rengøringsmidler har også identificeret elementer critical for korrekt foldning, såsom kravet om xanthophyll for LHCII kompleks (fx 1,11). Desuden har undersøgelser af egenskaberne af de enkelte pigmenter til komplekserne bundne været muligt ved hjælp af komplekser rekonstitueret in vivo (fx 10).
Den her beskrevne metode begynder med isolering af pigmenter (klorofyler og carotenoid) fra spinat og grønalgen Chlamydomonas reinhardtii. Udtrykket og rensning af LHC protein fra E. coli i form af inklusionslegemer derefter beskrevet, efterfulgt af rekonstituering af LHC og efterfølgende rensning ved Ni-affinitetssøjle. I det sidste trin er de rekonstituerede komplekser oprenses yderligere ved sucrosegradientcentrifugering at fjerne frie pigmenter og udfoldede apoprotein. Denne protokol udgør en optimeret procedure omfatter adskillige ændringer, som er blevet indført af forskellige laboratorier overtid 1,6,10,12 -14.
Membranproteiner er ikke så let at studere. Isolering af native membranproteiner kompliceres af nødvendigheden af at opløse lipiddobbeltlaget med rengøringsmidler, der kan beskadige protein og fjerne æteriske cofaktorer. Disse proteiner kan også være til stede i lave niveauer i biologiske membraner, eller blive blandet med de nært beslægtede proteiner, som i tilfældet af de lette høst komplekser, som gør oprensning af enkelte komplekser vanskelig. Heterolog proteinekspression i E. coli og in vitro-rekonstitution giver mulighed for at undgå disse problemer. in vitro rekonstitution og oprensning af foldede proteiner resulterer i komplekser, der besidder egenskaber, der meget ligner dem af de native komplekser 20,21,23 og dermed kan anvendes til at studere komplekser, der ikke kan renses til homogenitet 24 – 27.
Denne metode bruger spinat, som er let attainable året rundt, som en kilde til den samlede pigment og carotenoidpræparater. For nogle reconstitutions proteiner native for alger, er anvendelse af pigmenter oprenset fra alger foretrækkes på grund af forskellige pigmentsammensætninger. CHL a / b-forholdet og Chl / bil-forholdet forbliver den samme uanset pigment kilde.
Det er vigtigt at indse, at effektiviteten af rekonstituering er normalt omkring 35% 28. Det er derfor nødvendigt at fjerne ikke-bundne pigmenter og den udfoldede apoprotein fra opløsningen efter rekonstitution. En to-trins oprensningsprotokol præsenteres i denne protokol (se også resultater). Imidlertid bør det bemærkes, at saccharosegradienten trin ikke tillader fuldstændig adskillelse af Apo og holo-proteinet. Til de fleste analyser er dette ikke et problem, da apoproteinet ikke indeholder pigmenter og dermed ikke forstyrrer de funktionelle målinger. Men hvis det er nødvendigt fuldt ud at fjerne apoproteinet fra frhandling med den rekonstituerede kompleks (for eksempel, til at beregne pigmentet til protein støkiometri), kan der anvendes en anionisk bytning søjle (se Passarini et al. 2009 29 for detaljer).
Evnen til at refolde rekombinante lys høst proteiner med isolerede pigmenter in vitro giver en mulighed for at "manipulere" komplekserne ved at modificere rekonstituering "miljø" på forskellige måder, og derved ændre de særlige kendetegn ved det resulterende kompleks. For eksempel kan ændre pigmentsammensætningen under rekonstitution resultere i et kompleks med ændret pigmentsammensætning. Denne funktion kan anvendes til at undersøge indflydelsen af forskellige pigmenter har struktur og stabilitet af komplekset. Normalt præparatet opnåede pigment fra spinat har et Chl a / b-forhold på 3: 1 og en Chl / bil-forhold på 2,9: 1. Dette forhold giver typisk en rekonstitueret protein med de samme egenskaber som ntiv én. Imidlertid kan justering af Chl a / b-forhold ved tilsætning af oprenset Chl a eller b påvirke bindingen af forskellige pigmenter skyldes varierende selektivitet bindingsstederne 30 – 33. Dette er muligt, fordi de fleste af pigment bindingssteder er ikke helt selektive for Chl a eller Chl b, men kan rumme både, men med forskellig affinitet 10,30,34. På en tilsvarende måde blev carotenoid bindingssteder også vist sig at være i stand til at rumme mere end en xanthophyll arter 8,35 – 38. Forskellige reconstitutions af CP26, en anden pigment-protein-kompleks af højere planter, ved hjælp af forskellige pigmentsammensætninger er vist i tabel 2 39. Disse reconstitutions blev anvendt til at vurdere affiniteten af bindingssteder for bestemte pigmenter 39. Det er interessant at bemærke, at for at opnå et kompleks med samme pigment cAMMENSÆTNING som det native ene skal Chl a / b mellem pigment blanding være 3: 1. Dette synes at være tilfældet for alle LHC komplekser af højere planter 20,40.
Kombinationen af molekylær biologi med rekonstituering teknik muliggør egenskaberne af et Chl-bindende kompleks, der skal undersøges nærmere. Betydningen af forskellige protein domæner på stabilitet og foldning af komplekserne eller deres engagement i protein-protein interaktioner, er blevet bestemt ved trunkering apoproteinet eller udfører tilfældig mutagenese 8,41 – 44. Enkelt aminosyrerester vigtige for samordningen af de forskellige pigmenter kan ændres gennem mutagenese for at analysere egenskaberne af de enkelte pigmenter eller vurdere deres bidrag til funktion og stabilitet af komplekset 10,28,29,45 – 52. Figur 6 viser rekonstituerede Lhcb4 (CP29) meden mutation af histidin i position 216 53. En sammenligning af pigmentsammensætningen af vildtype og mutant komplekser viser, at mutationen inducerer tab af et Chl et molekyle, der angiver, at målstedet rumme et Chl a i WT komplekset. Forskellene i absorptionsspektre af WT og mutant ved normalisering til indholdet pigment, viser også absorptionsegenskaber tabte pigment. I dette tilfælde kan forskellen ses i de vigtigste top ved 680 nm, hvilket indikerer, at Chl en koordineret af His216 absorberer ved denne bølgelængde (for flere detaljer om denne mutant og spektroskopiske egenskaber se Mozzo et al. 2008 53). Mutation analyse kan også anvendes til at bestemme virkningen af miljøet på de spektroskopiske egenskaber af pigmenter 54.
Som konklusion kan lyshøstende proteiner let rekonstitueres in vitro resulterer i pigment-Protein komplekser med meget lignende egenskaber til indfødte komplekser. På denne måde er de vanskeligheder isolere native proteiner elimineres, samtidig med at levere præparatet protein med højt udbytte og renhed til yderligere undersøgelse. Betydningen af en 3: 1 Chl a / b-forhold i fremstilling af en autentisk kompleks understreges, og eksempler på rekonstitueret vildtype og mutant LHCs er tilvejebragt for at illustrere anvendelser af teknikken.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
Nylon cloth | 20 μm pores | ||
Soft artists paint brush | |||
NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
Beta-DM | Sigma | D4641 | |
DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
Milk Powders | |||
RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
Sonicator | |||
Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
TAP medium | see reference 17 | ||
LB medium | see reference 19 |