This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.
I planter og grønne alger, blir lyset fanget av lys-høsting komplekser (LHCs), en familie av integrerte membranproteiner som koordinerer klorofyll og karotenoider. In vivo, er disse proteinene foldet med pigmenter å danne komplekser som er satt inn i thylakoid membran i kloroplasten. Den høye likhet i de kjemiske og fysiske egenskaper for de medlemmer av familien, sammen med det faktum at de lett kan miste pigmenter under isolasjon, gjør deres rensing i en naturlig tilstand utfordrende. En alternativ tilnærming for å oppnå homogene preparater av LHCs ble utviklet av Plumley og Schmidt i 1987 1, som viste at det var mulig å rekonstruere disse kompleksene in vitro som starter fra rensede pigmenter og ubrettede apoproteiner, noe som resulterer i komplekser med egenskaper meget lik som opprinnelig komplekser. Dette åpnet veien til anvendelse av bakterielle uttrykte rekombinante proteiner for in vitro </em> tilberedning. Den rekonstituering metoden er kraftig av forskjellige grunner: (1) rene preparater av de enkelte komplekser kan oppnås, (2) pigment sammensetning kan kontrolleres for å vurdere deres bidrag til struktur og funksjon, (3) rekombinante proteiner kan bli mutert for å studere den funksjonelle rollen til den enkelte rester (f.eks pigmentbindingssteder) eller protein domene (f.eks protein-protein interaksjon, folding). Denne metoden har blitt optimalisert i flere laboratorier og brukes til det meste av lys-høsting komplekser. Protokollen er beskrevet her beskriver metode for rekonstituering av lys-høsting kompleksene in vitro i dag brukes i vårt laboratorium, og eksempler som beskriver anvendelser av fremgangsmåten er gitt.
Den fotoapparat av planter og alger omfatter integrerte membranproteiner som binder klorofyll a (CHL a), b (CHL b) og karotenoider (bil). Disse pigment-proteinkomplekser er aktive i høste lysenergi og overføring at eksitasjonsenergien til reaksjonssentre, hvor de benyttes til å fremme ladningsseparasjon 2. De er også involvert i regulatoriske tilbakekoblingsmekanismer som beskytter fotosynteseapparat fra høy lys skade 3,4. De lys høsting komplekser (LHCs) består av en stor familie av relaterte proteiner i planter og alger fem.
Den homogene rensing av hvert medlem av familien er blitt komplisert ved de svært lignende kjemiske og fysiske egenskaper for de komplekser. I tillegg rensefremgangsmåter resulterer ofte i tap av pigmenter eller andre potensielle kofaktorer slik som lipider. In vitro rekonstituering representants en kraftig metode for å overkomme disse problemene. LHC forbundet med photosystem II (LHC-II) ble først rekonstitueres in vitro ved Plumley og Schmidt i 1987 1. Forskerne ekstrahert delipidert protein og pigmenter separat fra plante-kloroplaster, og deretter kombinert varme denaturert protein med pigmentene i nærvær av litium Dodecyl Sulfate (LDS), etterfulgt av tre sykluser med frysing og tining 1. De viste at de spektrale egenskapene til det rekonstituerte LHC komplekser var svært lik komplekser renset fra planter. Den enkle rekonstituering LHC pigment-protein komplekser, sannsynligvis på grunn av noen iboende selvbygging funksjonen, sammen med vanskene med å isolere rensede komplekser fra organismer, førte til rask adopsjon av metoden av andre forskere. Den tilberedning av foto proteiner overuttrykkes i Escherichia coli (E. coli) ble oppnådd ved Paulsen og kolleger i 1990 seks. In E.coli, overuttrykkes membran proteiner er vanligvis finnes i inklusjonslegemer, som anlegg deres rensing. Rekonstituering er oppnådd gjennom varme-denaturering av inklusjonslegemer inneholdende rekombinant protein i nærvær av LDS, etterfulgt av tilsetning av pigmenter som initierer proteinfolding. Folding av LHCII komplekset er en to-trinns prosess: først, er klorofyll a bundet i mindre enn 1 min; andre, er klorofyll b bundet og stabilisert over flere minutter 7.
I tillegg til å gi innsikt i folde dynamikk, har in vitro rekonstituering kombineres med seterettet mutagenese tillot identifisering av spesifikke aminosyrer som er viktige for stabilitet (for eksempel 8,9) eller pigment koordinasjon (f.eks, 10). Manipulering av refolding forhold ved å justere parametere som pigment sammensetning eller vaskemidler har også identifisert elementer critical for riktig folding, slik som kravet xantofyller for LHCII kompleks (f.eks, 1,11). Videre har undersøkelser av egenskapene til de enkelte pigmenter som er bundet til kompleksene vært mulig ved hjelp av komplekser rekonstituert in vivo (for eksempel 10).
Metoden som beskrives her begynner med isolering av pigmenter (klorofyll og karotenoider) fra spinat og grønnalgen Chlamydomonas reinhardtii. Uttrykket og rensing av et LHC protein fra E. coli i form av inklusjonslegemene blir deretter beskrevet, etterfulgt av oppløsning av LHC og påfølgende rensing ved Ni affinitetskolonne. I det siste trinnet, er de rekonstituerte komplekser ytterligere renset ved sukrose-gradient sentrifugering for å fjerne frie pigmenter og utfoldet apoprotein. Denne protokollen representerer en optimalisert fremgangsmåte som omfatter flere modifikasjoner som har blitt introdusert av forskjellige laboratorier fordelttid 1,6,10,12 -14.
Membran proteiner er ikke så lett å studere. Isolering av innfødte membranproteiner er komplisert ved behovet for å oppløse lipidet bilaget med vaskemidler, som kan skade proteinet og fjerne nødvendige kofaktorer. Disse proteiner kan også være til stede i lave nivåer i biologiske membraner, eller blandes med nært beslektede proteiner, som i tilfelle av de lette høsting komplekser, som gjør rensing av enkelt-komplekser vanskelige. Heterologt protein ekspresjon i E. coli og in vitro rekonstituering gir mulighet for å unngå disse problemene. In vitro rekonstituering og rensing av foldede proteiner resulterer i komplekser som har egenskaper som var svært like de av de innfødte komplekser 20,21,23 og dermed kan brukes til å studere komplekser som ikke kan renses til homogenitet 24 – 27.
Denne metoden benytter spinat, som er lett attainable året rundt, som en kilde for den totale pigment og karotenoid-preparater. For noen reconstitutions proteiner innfødte for alger, er bruken av pigmenter renset fra alger foretrukket på grunn av forskjellige pigmentblandinger. Den Chl a / b-forhold og CHL / bil forholdet forblir den samme uavhengig av pigment kilde.
Det er viktig å være klar over at effektiviteten av rekonstituering er vanligvis rundt 35% 28. Således er det nødvendig å fjerne de ikke-bundne pigmenter og utbrettet apoprotein fra oppløsningen etter rekonstituering. En to-trinns rensing protokollen er presentert i denne protokollen (se også resultater). Imidlertid bør det bemerkes at sukrosegradient trinnet ikke tillater fullstendig atskillelse av Apo og holo-protein. For de fleste analyser er dette ikke et problem, som apoprotein ikke inneholder pigmenter, og dermed ikke forstyrre de funksjonelle målingene. Imidlertid, i tilfelle det er nødvendig å fullstendig fjerne apoprotein fra frhandling inneholdende rekonstituert kompleks (for eksempel for å beregne pigment til protein støkiometri), kan en anionisk bytterkolonne benyttes (se Passarini et al. 2009 29 for detaljer).
Kapasiteten til rekombinante refold lette høsting proteiner med isolerte pigmenter in vitro gir en mulighet til å "manipulere" kompleksene ved å endre rekonstituering "miljø" på ulike måter, for derved å endre egenskapene av det resulterende kompleks. For eksempel kan endre pigmentsammensetningen under rekonstitusjonen resultere i et kompleks med endret pigmentsammensetning. Denne funksjonen kan bli anvendt for å studere innflytelsen forskjellige pigmenter har på strukturen og stabiliteten av komplekset. Vanligvis pigmentet preparat oppnådd fra spinat har et Chl a / b-forhold på 3: 1 og en Chl / car-forhold på 2,9: 1. Dette forholdet gir vanligvis en rekonstituerte protein med samme egenskaper som den nAtive en. Imidlertid kan justeringen av Chl a / b-forhold ved tilsetning av renset Chl a eller b påvirke bindingen av forskjellige pigmenter på grunn av varierende selektivitet av bindingsstedene 30-33. Dette er mulig fordi de fleste av pigment bindingssteder er ikke helt selektiv for CHL en eller CHL b, men har plass til begge, men med forskjellig affinitet 10,30,34. På en lignende måte ble de karotenoide bindingssteder også vist å være i stand til å romme mer enn en xanthophyll arter 8,35 – 38. Forskjellige reconstitutions av CP26, et annet pigment-proteinkompleks av høyere planter, ved hjelp av forskjellige pigment sammensetninger er vist i tabell 2. 39. Reconstitutions Disse ble brukt til å vurdere affiniteten til bindingssteder for bestemte pigmenter 39. Det er interessant å merke seg at for å få et kompleks med samme pigment cSAMMENSETNING som native en må Chl a / b-forhold av pigment blanding være 3: 1. Dette synes å være tilfelle for alle LHC komplekser av høyere planter 20,40.
Kombinasjonen av molekylærbiologi med rekonstituering teknikken gir egenskapene for et Chl-bindende kompleks som skal utredes nærmere. Betydningen av ulike protein domener på stabilitet og folding av kompleksene, eller deres engasjement i protein-protein interaksjoner, er fastsatt av avkorting apoprotein eller utføre tilfeldig mutagenese 8,41 – 44. Enkeltaminosyrerester som er viktige for koordinering av forskjellige pigmenter kan bli endret ved sete-rettet mutagenese for å analysere egenskapene til de enkelte pigmenter eller vurdere deres bidrag til funksjonen og stabiliteten av komplekset 10,28,29,45 – 52. Figur 6 viser rekonstituert Lhcb4 (CP29) meden mutasjon av histidin i posisjon 216 53. En sammenligning av pigmentsammensetningen av villtype og mutante komplekser viser at mutasjoner forårsaker tap av en Chl et molekyl, som indikerer at det målsøkte setet kan tilpasses en Chl a i WT-komplekset. Forskjellen i absorpsjon spektra av WT og mutant, ved normalisering til pigmentinnhold, viser også de absorpsjons egenskapene til den tapte pigment. I dette tilfellet, kan forskjellen bli sett i hoved topp på 680 nm, noe som indikerer at CHL en koordinert av His216 absorberer på dette bølgelengde (for mer informasjon om dette mutant og spektroskopiske egenskaper se Mozzo et al. 2008 53). Kan også brukes Mutation analyse for å bestemme effekten av miljøet på de spektroskopiske egenskaper av pigmentene 54.
Som konklusjon kan lette høsting proteiner lett rekonstitueres in vitro som fører til pigment-Proteinkonn komplekser med svært like egenskaper som innfødte komplekser. På denne måten, er vanskelighetene med å isolere innfødte proteiner eliminert, samtidig levere protein forberedelse med høy kapasitet og renhet for videre studier. Betydningen av en 3: 1 Chl a / b-forhold på å produsere en autentisk komplekset er understreket, og eksempler på rekonstituert villtype og mutante LHCs er gitt for å illustrere anvendelser av teknikken.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
Nylon cloth | 20 μm pores | ||
Soft artists paint brush | |||
NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
Beta-DM | Sigma | D4641 | |
DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
Milk Powders | |||
RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
Sonicator | |||
Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
TAP medium | see reference 17 | ||
LB medium | see reference 19 |