Cytosolisk Kalsium Målinger i nyre Epitelceller med flowcytometri

Summary

Kalsium er involvert i en rekke fysiologiske og patofysiologiske signalveier. Levende celle bildebehandling krever spesialutstyr og kan være tidkrevende. En rask, enkel fremgangsmåte ved å bruke et strømningscytometer for å bestemme relative endringer i cytosolisk kalsium i adherente epitelceller bringes i suspensjon ble optimalisert.

Abstract

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Introduction

Kalsium er et viktig second messenger ansvarlig for overføring av cellulært fysiologiske og patofysiologiske signaler ^1. Cytosolisk kalsiumkonsentrasjonen holdes lavt gjennom aktiviteten av kalsium pumper og kalsiumvekslere. Det sarkoplasma / endoplasmatiske retikulum kalsium ATPase (SERCA) etterfyller det endoplasmatiske retikulum (ER) kalsium lagre som del av en "pumpe lekkasje" systemet, mens plasmamembranen kalsium ATPase (PMCA) ekstruderer kalsium til det ekstracellulære rommet, både i ATP-avhengige oppførsel ^2. Fysiologiske budbringere, slik som hormoner eller neurotransmittere, overfører deres signaler via G protein-koblede reseptorer, aktivering av fosfolipase C, som hydrolyserer fosfatidylinositol-4,5-bifosfat (PIP2) i plasmamembranen til å generere diacylglycerol og inositol-trifosfat (IP3) ^3. Mens diacylglycerol forblir i plasmamembranen, IP3 diffunderer inn i cytosol og binder seg til reseptoren IP3s (IP3Rs), som er ligand aktivert kalsiumkanaler, som finnes i ER membranen og kalsium frigjøres fra ER luminal butikken kulminerte i en økning i cytosoliske kalsiumkonsentrasjoner ^4. En alternativ rute for kalsium for å nå cytosol er gjennom kalsiumkanaler og vekslere som er tilstede i plasmamembranen. Crosstalk mellom disse to delene er beskrevet: kalsium indusert kalsium utgivelse (CICR) hvor ekstracellulære kalsium induserer kalsium utgivelse fra ER butikker ^5, og butikken drives kalsium oppføring (SOCE) der tømming av ER butikker registreres av STIM og forårsaker åpning av Orai kalsiumkanaler i plasmamembranen å fremme påfylling av ER butikker ^seks.

Under patofysiologiske betingelser, er den cellulære kalsiumrespons deregulerte og cytosoliske kalsium økninger i fravær av fysiologiske stimulatorer ^1. Den kalsium-respons kan bli påvirket på en rekke måter: langvarig kalsiumsignal, forsinket kalsium fjerning fra cytosol, uttømming av kalsium butikker eller lokaliserte forandringer i kalsium. Videre mitokondriene ta på seg en sentral rolle i bufring og slippe kalsium ^7. Langvarig og / eller supramaksimalt cytosolisk kalsium økning fører til celledød. Faktisk er kalsium oftere enn ikke involvert i den cellulære patofysiologisk respons og er en viktig hendelse i et bredt spekter av sykdommer, for eksempel neurodegenerative sykdommer, hjertesykdommer, kreft, skjelettsykdommer og nyresykdommer, som i hovedsak er assosiert med celledød og tap eller endring av organ eller vev funksjon ^8-10. Videre har perturbasjon av kalsiumsignaler vært knyttet til cellulær tilpasning og forandringer i cellulære funksjoner og responser.

Tradisjonelt er kalsium signaler målt med et negativt ladet fluorescerende kalsiumindikator som er lastet inn i celler i en cellepermeabel acetoksymetyl (AM) esterform. Når spaltes av cellulære Esterases, de fluorescerende indikatorer forblir innenfor det intracellulære rommet, og økning i fluorescensintensitet når kalsium er bundet. Den mest kjente og brukte kalsium indikator er proporsjonal Fura-2 er utviklet av Roger Tsien og kolleger ^11. Kalsium indikatorer med ulik affinitet for kalsium tillate ulike kalsium bassenger som skal overvåkes. Deteksjonsmetoder inkluderer levende celle bildebehandling, fluorescens mikroplateleser og flowcytometri. De relativt raske kinetikk av kalsium signaler (vanligvis i løpet av få sekunder til minutter) gjør levende celle bildebehandling den beste metoden for å få mest mulig informasjon om egenskapene til kalsium signal. Bortsett fra de raske kinetikk kalsiumsignaler (innenfor millisekunder), er live cell imaging en bedre metode for å studere cellulære compartmentalization av kalsium signalering innenfor en enkelt celle ^12. Absolutte kalsiumkonsentrasjoner kan beregnes ved å bestemme den minimale og maksimale fluorescens av kalsium indicator ved tilsetning av en kalsium chelator og permeabilizing cellene, henholdsvis, som beskrevet av Grynkiewicz et al., ^11.

Bruken av strømningscytometri for å måle kalsiumsignaler først ble utviklet i 1980-årene i immunologiske celler der mulighet til å måle flere parametere, slik som membranintegritet og separering av cellepopulasjon, og kravet av celler i suspensjon kombinert med utviklingen av enkelt bølgelengde kalsium indikatorer gjort flowcytometri en ideell og convenientdetection metode ^13-15. I heftende celler, tilbyr levende celle bildebehandling mest mulig informasjon om kalsium signalering, viktigst kinetikk, men krever en komplisert oppsett bestående av en fluorescens mikroskop, en perfusjon system, vedlikehold av mobilnettet miljø, for eksempel temperatur, og spesialisert mikroskop programvare for å anskaffe og analysere data. Alternative metoder slik som en fluorescens mikroplateleser eller Pharmacological midler gjennom bruk av kalsium chelatorene er makeløs i form av tjente informasjon. Strømningscytometri blir stadig mer utbredt brukt til å overvåke cytosolisk kalsium i adherente celler selv om det i de fleste studiene, bare ende-punkt-målinger er utført. Ved hjelp av metoden opprinnelig utviklet av Gergely et al. I immunologiske B-celler ¹⁶ har endringer i cytosolisk fri kalsium-konsentrasjon ved flowcytometri med sanntidskinetikk og overvåking av fluorescensintensiteten i de enkelte celler fra en prøve populasjon blitt målt hos kreft epitelceller og kreft stamceller hybrider ^17. Denne fremgangsmåte ble videre tilpasset for bruk i adherente epitel-celler, som er vanskelig å laste med kalsium indikatorer ^18.

Her, ved hjelp av en immortalisert adherent epitelisk cellelinje avledet fra S1 segment av rottenyre proksimale tubuli (WKPT-Cl.2 0293) ¹⁹ beskriver vi en optimalisert forenklet method for måling av endring i cytosolisk kalsiumkonsentrasjon ved strømningscytometri. Siden mange epitelceller besitter en rekke organiske transportører for anioniske forbindelser, kan lasting av celler med en kalsiumindikator vise seg å være en utfordring. For å hindre utstrømningen av kalsium indikatorer, probenecid, den prototypiske hemmer av organisk anion transportører og opprinnelig utviklet for å redusere renal utskillelse av penicillin ^20, brukes samtidig i inkuberingsmediet. Cellene blir opprettholdt i monolag kalsiumindikator for lasting, bringes i suspension og kalsiumsignaler kan detekteres umiddelbart etter tilsetning forbindelsen.

Protocol

1. Utarbeidelse av reagenser og løsninger Tilbered en modifisert Hanks balanserte saltløsning (HBSS) (i mM: NaCl 136,9, KCl 5,37, 0,34 Na2 HPO 4, 0,44 KH 2PO 4, 4,17 NaHCO3, pH 7,2, uten fenolrødt). Oppbevar ved 4 ° C. Gjør 1,5 M CaCl 2 og 2 M 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) (pH 7,2) stamløsninger ved hjelp av destillert vann. Forbered en 250 mM stamløsning av probenecid. For den frie syreformen (ofte refe…

Representative Results

For å øke cytosolisk kalsium ble to farmakologiske forbindelser brukes til nyreproksimaltubul celler (WKPT-0293 Cl.2) lastet med celle gjennomtrengelig kalsium bindende fargestoff, Fluo-3-AM. Ubehandlede kontrollprøver ble lastet med kalsiumbindende fargestoff i nærvær av probenecid og ble blandet, men uten tilsetning av noen forbindelser. Thapsigargin (TG) er en klassisk inhibitor av SERCA pumpe som fører til lekkasje ut av ER og resulterer i økt cytosolisk kalsium. Tunicamycin (TUN) blokkerer N-glykosyleringsse…

Discussion

Kalsium er et viktig hendelse i flere cellulære prosesser som virker som en andre budbringer signalmolekyl og også som et middel for å kommunisere mellom ER og mitokondrier. Muligheten til å måle endringer i frie cytosoliske kalsiumkonsentrasjoner er en nyttig teknikk som kan gjelde for alle områder av cellebiologi. Det finnes ulike metoder for å oppdage cytosoliske kalsium signaler. Klassisk, signaler fra en ratiometrisk kalsiumindikator, for eksempel Fura-2, blir overvåket i levende celler ved anvendelse av en…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Cell permeable
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line			Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)