Las mediciones del calcio citosólico en las células epiteliales renales mediante citometría de flujo

Summary

El calcio está implicado en numerosas vías de señalización fisiológicos y fisiopatológicos. Imágenes de células vivas requiere equipo especializado y puede llevar mucho tiempo. Un método rápido, simple utilizando un citómetro de flujo para determinar los cambios relativos en el calcio citosólico en las células epiteliales adherentes puestas en suspensión fue optimizado.

Abstract

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Introduction

El calcio es un segundo mensajero importante responsable de la transmisión de señales fisiopatológicos ¹ fisiológica celular y. Las concentraciones de calcio citosólico se mantienen bajos a través de la actividad de las bombas y los intercambiadores de calcio de calcio. La ATPasa de calcio del retículo / endoplasmático sarcoplásmico (SERCA) rellena el retículo endoplasmático (ER) de la tienda de calcio como parte de un sistema de "fuga de la bomba", mientras que la ATPasa de calcio de la membrana plasmática (PMCA) extruye calcio para el compartimiento extracelular, tanto en modales dependientes de ATP ^2. Mensajeros fisiológicos, tales como hormonas o neurotransmisores, transmiten sus señales a través de receptores acoplados a proteína G, activación de la fosfolipasa C, que hidroliza fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) en la membrana de plasma para generar diacilglicerol e inositol trifosfato (IP3) ^3. Mientras diacilglicerol permanece en la membrana plasmática, IP3 se difunde en el citosol y se une al receptor de IP3s (IP3Rs), que son los canales de calcio activados ligando, que se encuentran en la membrana del RE y el calcio se libera de la tienda luminal ER que culmina en un aumento de las concentraciones de calcio citosólico ^4. Una ruta alternativa para el calcio para alcanzar el citosol es a través de los canales de calcio e intercambiadores presentes en la membrana plasmática. Diafonía entre estos dos compartimentos se han descrito: la liberación de calcio inducida por calcio (CICR), donde el calcio extracelular induce la liberación de calcio desde las tiendas ER ^5, y la tienda que funciona la entrada de calcio (SOCE) donde el vaciado de las tiendas ER es detectada por STIM y provoca la apertura de Orai canales de calcio en la membrana plasmática para promover la recarga de las tiendas ER ^6.

En condiciones fisiopatológicas, la respuesta de calcio celular está desregulado y citosólicas aumentos de calcio en la ausencia de estimuladores fisiológicos ^1. La respuesta de calcio puede verse afectada en un número de maneras: calcio prolongaseñal, retraso en la eliminación de calcio desde el citosol, el agotamiento de las reservas de calcio o cambios localizados en el calcio. Además, las mitocondrias asumen un papel central en el almacenamiento en búfer y la liberación de calcio ^7. Prolongado y / o aumento de calcio citosólico supramáximo conduce a la muerte celular. De hecho, el calcio es más a menudo que no participa en la respuesta fisiopatológica celular y es un evento clave en una amplia gama de enfermedades, tales como enfermedad neurodegenerativa, enfermedad del corazón, cáncer, enfermedad ósea y la enfermedad de riñón, que se asocia principalmente con la muerte celular y la pérdida o alteración de la función de órgano o tejido ^8-10. Por otra parte, la perturbación de las señales de calcio se ha vinculado a la adaptación celular y cambios en las funciones celulares y las respuestas.

Tradicionalmente, las señales de calcio se miden con un indicador de calcio fluorescente cargado negativamente que se carga en las células en una forma de éster de acetoximetilo celular permeable (AM). Una vez escindida por esteras celulareses, los indicadores fluorescentes permanecen dentro del compartimento intracelular y el aumento de la intensidad de fluorescencia cuando se une el calcio. El indicador de calcio más conocido y utilizado es el radiométrico Fura-2 desarrollado por Roger Tsien y sus colegas ^11. Indicadores de calcio con diferentes afinidades para calcio permiten diferentes piscinas de calcio para ser monitoreados. Los métodos de detección incluyen imágenes de células vivas, lector de microplacas de fluorescencia y citometría de flujo. La cinética relativamente rápidas de señales de calcio (por lo general dentro de un par de segundos a minutos) hace que células vivas imágenes del mejor método para ganar la mayoría de la información sobre las características de la señal de calcio. Aparte de la cinética rápida de señales de calcio (dentro de milisegundos), imágenes de células vivas es un mejor método para el estudio de la compartimentación celular de señalización de calcio dentro de una sola célula ^12. Las concentraciones de calcio absolutos se pueden calcular mediante la determinación de la fluorescencia mínima y máxima de la ind calcioicator mediante la adición de un quelante de calcio y de permeabilización de las células, respectivamente, como se describe por Grynkiewicz et al. ^11.

El uso de citometría de flujo para medir las señales de calcio fue desarrollado por primera vez en la década de 1980 en las células inmunológicas, donde la oportunidad de medir varios parámetros, tales como la integridad de la membrana y la separación de la población celular, y la exigencia de células en suspensión combinada con el desarrollo de la única longitud de onda indicadores de calcio hacen citometría de flujo de un método ideal y convenientdetection ^13-15. En las células adherentes, imágenes de células vivas proporciona la mayoría de la información acerca de la señalización de calcio, lo más importante la cinética, pero requiere una instalación complicada que comprende un microscopio de fluorescencia, un sistema de perfusión, el mantenimiento del entorno celular, tales como la temperatura, y software especializado microscopio para la adquisición de y analizar los datos. Los métodos alternativos, tales como un lector de microplacas de fluorescencia o Pharmacolmedios gico a través del uso de quelantes de calcio son incomparables en términos de la información obtenida. La citometría de flujo es cada vez más ampliamente utilizados para monitorear el calcio citosólico en células adherentes, sin embargo, en la mayoría de estudios, sólo punto final de las mediciones se realizan. Utilizando el método desarrollado inicialmente por Gergely et al. En las células B inmunológicos ^16, los cambios en la concentración de calcio libre citosólico mediante citometría de flujo con la cinética en tiempo real y el seguimiento de la intensidad de fluorescencia en las células individuales a partir de una población de muestra se han medido con éxito en las células epiteliales de cáncer y de células madre de cáncer híbridos ^17. Este método fue adaptado, además, para su uso en células epiteliales adherentes, que son difíciles de cargar con indicadores de calcio ^18.

Aquí, usando una línea celular epitelial adherente inmortalizada derivada del segmento S1 del túbulo proximal del riñón de rata (WKPT-0293 CL.2) ^19, se describe un m simplificado optimizadoétodo para la medición de los cambios en la concentración de calcio citosólico por citometría de flujo. Dado que muchas células epiteliales poseen un número de transportadores orgánicos de compuestos aniónicos, la carga de las células con un indicador de calcio puede llegar a ser un reto. Para evitar que el flujo de salida de indicadores de calcio, probenecid, el inhibidor prototípico de los transportadores de aniones orgánicos y originalmente desarrollado para reducir la excreción renal de la penicilina ^20, se aplica simultáneamente en el medio de incubación. Las células se mantienen en monocapas de indicador de calcio de carga, llevados en señales de suspensión y de calcio pueden ser detectados inmediatamente después de la adición del compuesto.

Protocol

1. Preparación de Reactivos y Soluciones Preparar la solución de una sal equilibrada de Hank modificada (HBSS) (en mM: NaCl 136,9, KCl 5,37, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 de NaHCO3, pH 7,2, sin rojo de fenol). Almacenar a 4 ° C. Hacer 1,5 M CaCl 2 y 2 M 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) (pH 7,2) soluciones madre usando agua destilada. Preparar una solución madre 250 mM de probenecid. Por la f…

Representative Results

Para aumentar el calcio citosólico, dos compuestos farmacológicos se aplicaron a células renales proximales tubulares (WKPT-0293 CL.2) cargadas con colorante de unión a células de calcio permeable, Fluo-3 AM. Muestras de control no tratadas se cargaron con colorante de unión a calcio en presencia de probenecid y se mezclaron, pero sin la adición de ningún compuesto. Tapsigargina (TG) es un inhibidor de la bomba clásica SERCA dando lugar a fugas fuera de la ER y resulta en aumento de calcio citosólico. Tunicami…

Discussion

El calcio es un acontecimiento clave en múltiples procesos celulares que actúan como una segunda molécula de señalización mensajero y también como un medio para comunicar entre el ER y las mitocondrias. La capacidad de medir los cambios en las concentraciones de calcio libre citosólico es una técnica útil que puede aplicarse a todas las áreas de la biología celular. Hay varios métodos para detectar señales de calcio citosólico. Clásicamente, las señales de un indicador de calcio radiométrico, como Fura-…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Cell permeable
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line			Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)