Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri
Summary
Kalsiyum çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik sinyal yollarında rol oynamaktadır. Canlı hücre görüntüleme özel ekipman gerektirir ve zaman alıcı olabilir. Süspansiyon haline getirilmiştir yapışık epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyum göreli değişiklikleri belirlemek için bir akış Sitometreyi kullanarak hızlı, basit bir yöntem optimize edilmiştir.
Abstract
A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.
Introduction
Kalsiyum hücre fizyolojik ve patofizyolojik sinyallerinin 1 aktarılmasından sorumlu önemli bir ikincil habercidir. Sitozolik kalsiyum konsantrasyonları kalsiyum pompaları ve kalsiyum değiştirgeçlerinin aktivite yoluyla düşük tutulur. Sarkoplazmik / endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz'ın (SERCA) ATP'ye bağımlı şekillerde hem de plazma membran kalsiyum ATPaz'ın (PMCA) Hücre dışı bölüme kalsiyum ekstrüde ise "pompa kaçak" sisteminin bir parçası olarak endoplazmik retikulum (ER), kalsiyum deposunu doldurabilir 2. Gibi hormonlar veya sinir taşıyıcıları gibi fizyolojik haberciler, G-proteini ile bağlanmış reseptörler, diasilgliserol ve inositol trifosfat (IP3) 3 oluşturmak için, plazma membranında, fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) hidrolize eden, fosfolipaz C aktivasyonu yoluyla iletir. Diaçilgliserol plazma membranında kalırken, IP3 sitozol içine girer ve IP3 reseptörüne bağlananER membran ve kalsiyum bulunan bağ kalsiyum kanallarını aktive S (IP3Rs), sitozolik kalsiyum konsantrasyonları 4 bir artışa sonuçlanan ER lümen deposundan salınır. Sitoplazmada ulaşmak için kalsiyum için alternatif bir yol, plazma membranında bulunan kalsiyum kanallarda ve değiştiricilerde geçer. Bu iki bölme arasındaki çapraz karışma tarif edilmiştir: kalsiyum kaynaklı kalsiyum dışı kalsiyum ER depolar 5 kalsiyum serbest kalmasına sebep olur salım (YÜÇAM) ve depolamak stimülasyonu tarafından algılanan ER mağaza boşaltılmasından kalsiyum girişini (Soce) çalıştırılabilir ve Orai açılmasına neden olur plazma membranında kalsiyum kanalları ER mağaza 6 yeniden dolmasını teşvik etmek.
Patofizyolojik koşullar altında, hücresel kalsiyum tepki de fizyolojik uyarıyıcıya 1 yokluğunda serbest ve sitosolik kalsiyum artar. Kalsiyum yanıtı çeşitli yollarla etkilenebilir: kalsiyum uzun sürelisinyali, sitosolden kalsiyum çıkarılmasını, kalsiyum mağazalarda veya kalsiyum lokalize değişikliklerin tükenmesi erteledi. Ayrıca, mitokondri tamponlama merkezi bir rol almak ve kalsiyum 7 serbest. Uzun süreli ve / veya supramaksimal sitosolik kalsiyum artışı hücre ölümüne sebep olur. Aslında, kalsiyum daha çok hücresel patofizyolojik yanıtta ve bu tür daha çok hücre ölümü ile ilişkili nörodejeneratif hastalık, kalp hastalığı, kanser, kemik hastalığı ve böbrek hastalığı gibi hastalıklar, geniş bir dizi önemli bir olay değildir daha kayıp veya organ veya doku işlevinin 8-10 değiştirilmesi ve. Üstelik, kalsiyum sinyallerinin pertürbasyon hücre uyarlanması ve hücresel işlevleri ve yanıtları değişikliklere bağlanmıştır.
Geleneksel olarak, kalsiyum sinyalleri hücre geçirgen asetoksimetil (AM) bir ester formunda hücrelere yüklenen bir negatif yüklü bir fluoresan kalsiyum göstergesi ile ölçülür. Bir kez hücre esteras parçalanabilenES floresan göstergeler hücre bölmesi içinde kalır ve kalsiyum bağlı olduğunda, flüoresans yoğunluğunda artış. En iyi bilinen ve kullanılan kalsiyum göstergesi rasyometrik Fura-2 Roger Tsien ve arkadaşları 11 tarafından geliştirilen. Kalsiyum için farklı afinitelerle kalsiyum göstergeleri farklı kalsiyum havuzları izlenmesine olanak tanır. Tespit yöntemleri, canlı hücre görüntüleme, floresan mikroplaka okuyucu içerir ve akış sitometresi. (Genellikle birkaç dakika için birkaç saniye içinde) kalsiyum sinyallerinin görece hızlı kinetik kalsiyum sinyalinin özellikleri hakkında en çok bilgi kazanmak için en iyi yöntem görüntüleme canlı hücre yapar. Kenara (milisaniye içinde) kalsiyum sinyallerin hızlı kinetik, canlı hücre görüntüleme tek bir hücrenin 12 içinde kalsiyum sinyal hücresel compartmentalization çalışmak için iyi bir yöntemdir. Mutlak kalsiyum konsantrasyonları kalsiyum ind minimum ve maksimum floresans belirlenmesi ile hesaplanabilirGrynkievvicz et al. 11 tarafından tarif edildiği gibi, sırasıyla, bir kalsiyum tutucusunun eklenmesi ve hücrelerin geçirimli ile icator.
Kalsiyum sinyallerinin ölçülmesi için akış sitometrisi kullanımı, ilk olarak bir fırsat zar bütünlüğü ve hücre grubunun ayrılması ve tek bir dalga boyu gelişimi ile birlikte süspansiyon içinde hücrelerin gereği olarak, birden çok parametre ölçmek için burada immünolojik hücrelerde 1980'li yıllarda geliştirilen kalsiyum göstergeler bir ideal ve convenientdetection yöntemle 13-15 flow sitometri yaptı. Yapışık hücrelere, canlı hücre görüntüleme kalsiyum sinyalizasyonu, en önemlisi kinetiği hakkında en çok bilgi sağlar, ancak elde etmek için bir sıcaklık gibi bir floresan mikroskop, bir perfüzyon sistemi, hücresel çevre bakımı, oluşan karmaşık kurulum ve özel mikroskop yazılım gerektirir ve verileri analiz. Bu tür bir floresan mikroplaka okuyucu ya da Pharmacol gibi seçenek yöntemlerKalsiyum kenetleme maddelerinin kullanımı yoluyla ogical araçları elde edilen bilgilerin açısından eşsiz. Akış sitometrisi, daha yaygın olarak, çalışmaların çoğunda olsa da, ölçümler yapılmıştır sadece son-nokta yapışık hücreler sitosolik kalsiyum izlemek için kullanılabilir hale gelmektedir. Başlangıçta Gergely ve arkadaşları tarafından geliştirilen yöntem kullanılarak. Imünolojik B hücreleri 16, gerçek zamanlı kinetiği olan akış sitometrisi ve bir numune bir gruptan hücrelerinde floresan yoğunluğunun izlenmesi ile sitosolik serbest kalsiyum konsantrasyonunda değişiklikler başarıyla kanser epitelyal hücrelerinde ölçülmüştür ve kanser kök hücresi 17 melezler. Bu yöntem, bundan başka, kalsiyum göstergeleri 18, yükleme zordur yapışık epitel hücrelerinde, kullanım için adapte edilmiştir.
Burada, sıçan böbrek proksimal tübül (WKPT-0293 CL.2) 19 S1 kısmında elde edilen ölümsüzleştirilmiş yapışkan epitel hücre soyunu kullanarak, biz, optimize edilmiş bir basitleştirilmiş m açıklamakAkış sitometrisi ile sitosolik kalsiyum konsantrasyonundaki ^ değişikliklerin ölçülmesi için METOT. Birçok epitel hücreleri anyonik bileşikler için organik taşıyıcıların bir dizi sahip olduğu için, bir kalsiyum göstergesi ile hücrelerin yük bir meydan okuma olarak kanıtlamak olabilir. Kalsiyum göstergeleri, probenesid, penisilin 20 ekskresyonun düşürmek için geliştirilmiş başlangıçta prototipik organik anyon nakil inhibitörü ve akışını önlemek için, kuluçkalama ortamı içinde eş zamanlı olarak uygulanır. Hücreler, kalsiyum indikatör yükleme için tek tabaka halinde tutulan bir bileşik ilave edildikten sonra hemen tespit edilebilir süspansiyon ve kalsiyum sinyalleri haline getirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kalsiyum ikinci mesajcı sinyal molekülü olarak ve aynı zamanda, ER ve mitokondri arasında iletişim kurmak için bir araç olarak hareket eden bir çok hücresel süreçlerde önemli bir olaydır. Ücretsiz Sitozolik kalsiyum konsantrasyonları değişiklikleri ölçmek için yeteneği hücre biyolojisi tüm alanlarında uygulayabileceğiniz yararlı bir tekniktir. Sitozolik kalsiyum sinyalleri algılamak için çeşitli yöntemler vardır. Klasik olarak, bu tür Fura-2 gibi, bir oran ölçer kalsiyum göstergesi, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuvarlarda araştırma Fritz-Bender Vakfı, Münih, Almanya (TD) ve (W.-KL) Witten / Herdecke iç araştırma bursu bir üniversite tarafından finanse edilmektedir. Biz yararlı önerileri için (Fizyoloji, Patofizyoloji ve Toksikoloji, Witten Üniversitesi / Herdecke için Institute) Prof Dr. Frank Thévenod teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
- Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
- Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
- Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
- Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
- Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it’s good, it’s very very good, but when it’s bad, it’s horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
- Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
- June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
- Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
- Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
- Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
- Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
- Beyer, K. H., et al. Benemid,’ p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
- Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
- Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
- Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
- Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
- Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
- Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
- Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
- Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).
