Интрацеребровентрикулярное Вирусный Инъекция по неонатологии мозга мыши для устойчив и распространен нейронов трансдукции
Summary
Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.
Abstract
С темпы научного прогресса быстро ускоряется, новые методы необходимы для экспериментальной неврологии быстро и легко манипулировать экспрессии генов в мозге мыши. Здесь мы опишем технику впервые введено Пассини и Вулф для прямого внутричерепного доставки вирусно-кодированных трансгенов в неонатальном мозге мыши. В своей самой базовой форме, процедура требует только ведро со льдом и микролитровых шприц. Однако протокол также может быть адаптирована для использования с стереотаксических кадрами чтобы улучшить согласованность для исследователей новых к технике. Метод основан на способности адено-ассоциированный вирус (AAV) свободно перемещаться из желудочков головного мозга в паренхиме головного мозга в то время как эпендимных подкладка еще незрелый в течение первых 12-24 часов после рождения. Внутрижелудочковая инъекция AAV в этом возрасте приводит к широко распространенной трансдукции нейронов по всему мозгу. Выражение начинается через несколько дней после инъекции и сохраняется в течение lifetimэлектронной животного. Титр вируса можно регулировать, чтобы контролировать плотность трансдуцированных нейронов, в то время как совместная экспрессия флуоресцентного белка обеспечивает важную метку трансдуцированных клеток. С ростом доступности вирусных основных объектов обеспечения и вне-полки, расфасованные реагенты и заказ вирусный препарат, такой подход предоставляет своевременную способ манипулирования экспрессию генов в мозге мыши, которая быстро, легко, и гораздо дешевле, чем традиционные зародышевой инженерии.
Introduction
Традиционные методы для модификации выражение нейронной гена требуют трудоемких и дорогостоящих зародышевых манипуляций. Альтернативный De Novo подходов, таких как внутриутробное электропорации или стереотаксической инъекции лентивирусов дают более быстрые результаты и являются менее дорогостоящими, но имеют тот недостаток, что требует сложного хирургического вмешательства 1-3. Кроме того, выражение трансгена имеет ограниченный пространственный спектр с этими методами. Здесь мы опишем быстрый, легкий, и экономичный метод для широкого нейронов манипуляции с помощью внутрижелудочкового введения аденоассоциированного вируса (AAV) в неонатальном мозге мыши. Этот метод был впервые описан John Wolfe и Marco Пассини в 2001 году, где они предложили малый размер частиц AAV позволило ему диффундировать в спинно-мозговой жидкости, когда она проходит от боковых желудочков через незрелых эпендимных барьер и в паренхиме головного мозга 4, 5. Внутрижелудочковая инъекция AAV в фрежде 24 ч после рождения урожайности широко распространены вирусная трансдукции нейронных подмножеств, охватывающих все области мозга, от обонятельных луковиц в стволе головного мозга 6,7. Виралли устанавливаемые трансгены выражены и активным в течение нескольких дней инъекции и сохраняться в течение до одного года после трансдукции. Таким образом, этот универсальный манипуляции позволяет исследования, начиная от раннего развития послеродовой мозга старения и дегенерации у взрослых.
При адаптации технику к нашим конкретных экспериментальных потребностей, мы были сосредоточены в основном на AAV8 серотипа, потому что это самый эффективный на трансдуцирующих нейроны 6. Мы покажем, что титр вируса может быть разбавлен контролировать плотность трансдуцированными нейронов для сотовых-внутренняя последствий тестирования эксперименты генетических манипуляций. Кроме того, мы показываем, что два вируса могут совместно вводят производить паттерны экспрессии, которые смещены в сторону различных или совпадающих наборов нейронов, в зависимости от серотипов, выбранных длявирусная упаковка. Наша работа расширяет универсальность этой методики для использования в широком диапазоне экспериментальных условиях Neuroscience.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описали универсальный порядок манипулирования выражение нейронов генов с помощью AAV как транспортное средство для широкого доставки в неонатальном мозге мыши. По сравнению с другими методами нейронов трансгенеза, например, внутриутробное электропорации 1 или стереотаксичес…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4 | 32 gauge, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
References
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
- Sun, B., Gan, L. Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors. Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).
- Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J Virol. 75, 12382-12392 (2001).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77, 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PloS one. 8, (2013).
- Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy. Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).
- Bauer, H. C., Bauer, H. Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma. Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).
- Cearley, C. N., et al. Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).
- Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82, 5887-5911 (2008).
