Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada
Summary
Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.
Abstract
Con el ritmo de los avances científicos en rápida aceleración, se necesitan nuevos métodos de la neurociencia experimental para manipular rápida y fácilmente la expresión génica en el cerebro del ratón. Aquí se describe una técnica introducida por primera Passini y Wolfe para la entrega intracraneal directa de transgenes codificada por el virus en el cerebro del ratón neonatal. En su forma más básica, el procedimiento sólo requiere un cubo de hielo y una jeringa de microlitro. Sin embargo, el protocolo también se puede adaptar para su uso con los marcos estereotáxica para mejorar la consistencia de investigadores nuevos en la técnica. El método se basa en la capacidad del virus adeno-asociado (AAV) para moverse libremente de los ventrículos cerebrales en el parénquima cerebral, mientras que el revestimiento ependimario es todavía inmaduros durante las primeras 12-24 horas después del nacimiento. La inyección intraventricular de AAV en esta edad los resultados en la transducción generalizada de neuronas en todo el cerebro. Expresión comienza pocos días después de la inyección y persiste durante la lifetime del animal. Título viral se puede ajustar para controlar la densidad de las neuronas transducidas, mientras que la co-expresión de una proteína fluorescente proporciona una etiqueta vital de las células transducidas. Con la creciente disponibilidad de las instalaciones del núcleo viral para proporcionar reactivos tanto off-the-shelf, pre-envasados y preparación personalizada viral, este enfoque ofrece un método oportuno para la manipulación de la expresión génica en el cerebro del ratón que es rápido, fácil y mucho menos costoso que la ingeniería de línea germinal tradicional.
Introduction
Los métodos tradicionales para la modificación de la expresión de genes neuronales requieren tiempo y es costoso manipulaciones de la línea germinal. Alternativa de novo enfoques tales como la electroporación en el útero o la inyección estereotáxica lentiviral producir resultados más rápidos y son menos costosos, pero tienen la desventaja de requerir una intervención quirúrgica compleja 1-3. Además, la expresión transgénica tiene un rango espacial limitada con estos métodos. En este documento, se describe un método rápido, fácil, y económico para la manipulación neuronal generalizada a través de la inyección intraventricular de virus adeno-asociado (AAV) en el cerebro de ratón neonatal. El método fue descrito por primera vez por John Wolfe y Marco Passini en 2001, donde se sugirieron pequeño tamaño de partícula de AAV permitió que se difunda dentro del fluido espinal cerebral a medida que pasa desde los ventrículos laterales a través de la barrera ependimaria inmaduro y en el parénquima cerebral 4, 5. La inyección intraventricular de AAV dentro de la frimero 24 hr después de los rendimientos de nacimiento de transducción viral generalizada de subconjuntos neuronales que abarcan todas las regiones del cerebro, de los bulbos olfativos al tallo cerebral 6,7. Transgenes Virally entregados-se expresan y se activa a los pocos días de la inyección y persisten hasta por un año después de la transducción. Por lo tanto, esta manipulación versátil permite estudios que van desde el desarrollo del cerebro postnatal temprano con el envejecimiento y la degeneración en el adulto.
Al adaptar la técnica a nuestras necesidades experimentales específicos, nos hemos centrado principalmente en AAV8 serotipo debido a que es el más eficiente en la transducción de las neuronas 6. Se demuestra que el título viral se puede diluir para controlar la densidad de las neuronas transducidas para experimentos de prueba consecuencias de células intrínseca de la manipulación genética. Además, se demuestra que dos virus podrían ser co-inyectados para producir patrones de expresión que se polarizan hacia los conjuntos de neuronas distintas o coincidentes, dependiendo de los serotipos elegidas paraembalaje viral. Nuestro trabajo se expande la versatilidad de esta técnica para su uso en una amplia gama de parámetros experimentales neurociencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito un procedimiento versátil para manipular la expresión génica neuronal usando AAV como vehículo para la entrega generalizada en el cerebro de ratón neonatal. En comparación con otros métodos de transgénesis neuronal tales como electroporación en el útero 1 o inyección intracraneal estereotáxico 2,3, inyección viral neonatal es relativamente fácil y simple. El procedimiento básico se puede realizar en minutos con sólo un cubo de hielo y una jeringa de microlitro. Superv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4 | 32 gauge, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
References
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