在小鼠大脑的各个区域端粒酶活性：非放射性端粒酶重复序列扩增法（TRAP）分析
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
端粒酶，核糖核蛋白，是负责维持端粒的长度，从而推动基因组的完整性，细胞增殖和寿命。此外，端粒酶免受氧化应激线粒体和赋予抗细胞凋亡，表明如神经元非有丝分裂的，高活性的细胞的尚存其可能的重要性。我们以前表明的新颖端粒酶的活化剂，以增加端粒酶活性和表达在各种小鼠的大脑区域，并保护运动神经元细胞免受氧化应激的能力。这些结果加强了端粒酶是参与神经元的各种病变的保护的概念。强调端粒酶在脑的作用，我们在这里比较端粒酶在雄性和雌性小鼠大脑的活性和其对年龄依赖性。 TRAP法是在各种组织或细胞系中检测端粒酶活性的标准方法。在这里，我们展示了analy端粒酶活性在小鼠大脑的三个区域的sis通过非变性使用CHAPS蛋白提取裂解缓冲后跟标准TRAP法的变形例。
在这两步法，内源性端粒酶拉长特定端粒酶衬底（TS引物）加入TTAGGG 6 bp的重复序列（端粒酶反应）。端粒酶反应产物进行PCR反应创造了6个基点为单位的DNA阶梯放大。的DNA梯状条带的分析是由4.5％的高分辨率琼脂糖凝胶电泳，然后用高灵敏度的核酸染色剂染色制成。
相比于使用32 p标记的放射性的dCTP的用于DNA检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳对解决该DNA梯的传统TRAP法，该协议提供了一种无毒的时间节省TRAP法评价端粒酶活性在小鼠脑，展示出的能力检测端粒酶的差异E活动中的各种女性，雄性小鼠的大脑区域。
Introduction
端粒酶是一种端粒酶的组成核糖核蛋白逆转录酶（TERT），端粒酶催化亚基和RNA组分（TERC）。端粒酶的规范作用是通过将重复序列（TTAGGG）的端粒末端，因此促进基因组的完整性，以及细胞的增殖1保持端粒的适当长度。其他角色归因于TERT在细胞中， 即它赋予对诱导细胞凋亡的各种损伤剂2，保护免受氧化应激3人间充质干细胞，并通过其关联到TIA1阳性RNA起着完全分化的神经元的促存活作用颗粒4。
TERT表达和活性，主要在体分裂的细胞，并在大多数类型的癌症，而酶的表达和活性水平在非分裂细胞5,6紧密调节。有研究显示，在第rodent脑，端粒酶活性检测不到就由出生后10天，而TERT mRNA的维持在较低水平到成年7。其他研究表明成年子脑室区，嗅球，海马内端粒酶活性，并且在成人小脑和皮层8。我们最近证明了增加在大脑和脊髓中端粒酶的表达和活性的新化合物作用于N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）的神经保护作用 – 注射的小鼠，延迟的肌萎缩性侧索硬化病的SOD1转基因的发作和进展小鼠和增加运动神经元的存活在这些小鼠9的脊髓。要充分了解端粒酶在神经元和大脑中的促存活作用，有必要开发一种简单和相对敏感的快速测定端粒酶活性在脑的各个区域的检测。
端粒ŘEPEAT扩增法（TRAP）是一个众所周知的敏感测定法结合端粒酶的典型活性和聚合酶链式反应（PCR）。在该试验中，端粒酶添加TTAGGG重复到端粒酶衬底（TS引物）的寡核苷酸，然后通过PCR扩增，产生6个碱基对（bp）的使用TS的反向引物的DNA梯- ACX 32 p标记的dCTP的被用于检测的PCR产物的量低。的DNA梯状条带是由测序聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）解决。两个DNA带的强度和DNA片段化的长度反映活性酶分子的数量和它们的持续合成能力分别为10。
这种传统的检测容纳了一些重大的困难：暴露于放射性物质，大和难以处理的测序PAGE和凝胶运行的时间消耗和放射性产物的膜曝光（过夜在这两种情况下）的危险。 </p>
该协议提供了一种改进的无放射性的琼脂糖微凝胶基础的检测。该DNA 6 bp梯度是使用4.5％的高分辨率琼脂糖凝胶上分辨并使用该检测，实现高灵敏度的核酸染色。使用高分辨率的琼脂糖微凝胶和敏感核酸染色的组合提供了易于处理法，可以消除暴露于放射性的危险和显著缩短为3天总测定时间至几小时。
Protocol
Representative Results
Discussion
在通过TRAP法对小鼠脑细胞端粒酶活性的分析包括4个主要步骤：1）蛋白质从脑组织2）特定地区开采端粒酶TS引物延伸 – 端粒酶反应3）的端粒酶反应产物PCR扩增4 ）的分离使用高分辨率琼脂糖凝胶对PCR产物。
这种改良TRAP法解决了上升，从传统的检测两大困难：使用放射性的dCTP的灵敏检测PCR产物和PAGE分离的DNA梯状的。高分辨率琼脂糖凝胶简化了端粒酶的反应产物的检测（将DNA?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
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