Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem
Summary
Floresan probları içeren poliakrilamid (PA) jelleri imal edilmesi için geleneksel teknikler yapışkan bir yüzeyi ve bir cam kayar arasında sandviç tarzı bir jel barındırır. Burada, poli-D-lisin (PDL) ve fluoresan problar, bu slayt kaplama jel yüzeyinden 1.6 um olan probları lokalize olduğunu göstermektedir.
Abstract
Pensilvanya jeller uzun imalat ve nağme elastik özelliklerini yeteneği kolaylığı nedeniyle hücre çekiş kuvvetleri incelemek için bir platform olarak kullanılmıştır. Alt-tabaka, bir hücre dışı matris proteini ile kaplanmıştır zaman hücreler, jele yapışmayan ve jel deforme neden kuvvetler uygulanır. Bu deformasyon, hücre çekiş ve jelin elastik özelliklerine bağlıdır. Yüzeyinin deformasyonu alanı biliniyorsa, yüzey çekme esnekliği teorisi kullanılarak hesaplanabilir. Jel deformasyon genellikle homojen jel içine fluoresan işaretleyici boncuklar içine gömülmesiyle ölçülür. Jel deforme olarak probları değiştirmesine neden olmaktadır. Jel yüzeyine yakın sondalar izlenir. Bu problar tarafından bildirilen değiştirmeler yüzey değiştirmeler olarak kabul edilir. Yüzeyden Bunların derinlikleri göz ardı edilir. Bu varsayım çekiş kuvveti değerlendirmelerde hata tanıtır. Boncukların yer bilinmesi için hücre güçlerinin hassas ölçümü için, bu önemlidir. Biz geliştirdikyüzeyinin 1.6 um olan PA jellerinde, floresan markörü boncuklar, çapı 0.1 ile 1 um sınırlandırmak için basit kimyası kullanan bir teknik sunmaktır. Bu kat, poli-D-lisin (PDL) flüoresan boncuklar ile bir lamel. PA jel çözeltisi, sonra da lamel ve yapışkan bir yüzeyi arasında yer alır. Floresan boncuk kür sırasında jel çözeltisine transfer. Polimerizasyondan sonra, PA jel jel yüzeyine yakın bir düzlem üzerinde floresan boncuklar içerir.
Introduction
Yerel çevre ile yaşayan hücrenin mekanik etkileşim yaygın Pensilvanya jeller kullanılarak incelenmiştir. Bu alt-tabakalar, bu alt-tabakaların en önemli avantajlarından 1. Biri 1997 yılında Dembo ve Wang tarafından kurulan basit, iyi karakterize edilmiş protokolüne dayanan kendi sertliği jel solüsyonunun özel bileşenlerin konsantrasyonlarını değiştirerek ayarlanabilir olmasıdır. Bu, farklı katılıklarla ortamlarda hücrelerin etkileşimi incelemek için bir arzu platform sağlar. PA jeller, hücre dışı matris (ECM), proteinleri ile kaplanmış olduğunu zaman, hücreler kuvveti oluşturarak, bunlara yapışır. Hücre kuvvetin sonucu olarak, jel elastik bir gövde olarak deforme eder. Bu deformasyon, hücrelerin ve jelin elastik özellikleri tarafından uygulanan kuvvetin büyüklüğüne bağlıdır. Çeşitli çalışmalarda hücresel çekiş kuvvetleri araştırmak PA jelleri istihdam var.
PA jel imalat Bir varyasyonda, floresan mikrosferler (boncuk) t gömülürfarklı bükülmezliklerde 2 jelleri üzerinde çekme kuvvetlerinin hücre miktarını belirlemek için jel hroughout. Hücre kuvvet başvuru üzerine, boncuk jel izleyen deformasyon onların ilk konumdan yerinden. Deformasyon alan tek tek kordonların ölçülür. Bu deformasyon alan esneklik teorisi ile çekme kuvvetlerinin hesaplanması için jelin elastik özellikleri kullanılmaktadır. Bu ölçümler hücreler mekanik duygusu ve kendi yerel mikroçevresinin 3 ile etkileşim olarak nasıl fikir verir.
Yaygın olarak kullanılan bir çok Pensilvanya jel üretim protokolleri, haplar, sıvı, polimerize edilmemiş halde PA, jel boyunca birbirine karıştırılır. Tam polimerleştirilmiş jel, Pensilvanya hacmi boyunca flüoresan boncuklar içerir. Hücre çekme kuvvetlerinin işlem olduğunda, jel yüzeyi (hücre alt-tabaka arayüzü) yakınındaki en boncuklar izlenir. Bu tür boncukların değiştirmeler kuvvet calculatio basitlik için hücre kültürü yüzeyinde meydana varsayılmaktadırn. Jelin derinliğinde boncukların gerçek konumu göz ardı edilir. Bununla birlikte, elastik bir ortamda (örneğin, Pensilvanya jel gibi), bir kuvvet tatbiki bir noktaya yakın bir kordon daha uzak bir noktadan bir boncuk daha hareket eder. Böylece, hücresel traksiyonların düşük hesaplanmasına yüzey sonuçlara edilene yüzeyden uzak (boncuk yerde) bir noktanın yer değiştirmesi muamele edilmesini içerir. Hatanın derecesi yüzeyinden kordonun uzaklığa bağlıdır. Hata kordonun konumu bilgisi olmadan tahmin edilemez.
Çok hücre kültürü yüzeye yakın boncuk sınırlandırmak için basit bir yönteme ihtiyaç birkaç teknikleri ile ele alınmıştır. Araçlardan biri, çok yüzeye yakın hareketini ölçmek için üst odak düzlemi boncuk yeterli sayıda olacak şekilde bütün jel boyunca boncuk yoğunluğunu artırmaktır. Bir başka teknik, ışık o canlı hücre görüntüleme için bir konfokal görüntüleme odası inşa içerirüst en odak düzlemi sadece boncuk 4 toplanır. Farklı bir yöntem taneleri 5 olmayan bir önceden polimerize edilmiş jelinin üzerine boncuklar içeren PA jel son derece ince bir katmanı üzerinde içerir. Bu tekniklerin bir dezavantajı, her birinin, jel içindeki boncukların hassas konum bilinmemektedir olmasıdır. Bu boncuklar yer değiştirme alanı ve bu yüzden, hücre kuvvetlerin hesaplanması hesaplamaya dahil hata olarak yansır. Bir başka teknik, Sülfo-SANPAH 6 kullanılarak hali hazırda polimerize PA jel üst yüzeyine boncuk konjugasyon içerir. Bu teknik, tek taneler PA jel üzerinde gerçekten de sağlar, fakat jelin derinlikte gömülü ne ölçüde bilinmemektedir. Önce iş hücreleri gücü birkaç mikron uzaklıkta 7 hissedebiliyorum önerdi gibi bu potansiyel, hücre davranışını değiştirebilir hücreler, bir yerel topografya oluşturabilirsiniz. Son zamanlarda, 1 mikron çaplı f PA jeller desenlendirme için bir tekniktirdüzenlilestirilmis dizi luorescent fibronektin nokta belirteçler 8 kurulmuştur. Bu durumda, flüoresan işaretler derinliği bilinir ve fibronektin model dolaylı jel yüzey üzerine baskı gibi, esas olarak sıfırdır. Bununla birlikte, bu yöntem, ECM protein 1 mikron çaplı noktalar, olduğu gibi hücreler, ekleyebilir üzerinde sürekli bir ortam sağlamaz. Tamamen yüzeye çok yakın bilinen bir konuma Pensilvanya jeller içinde izci boncuk entegre ve hapsedilmesini için bir yöntem henüz kurulamamıştır.
Burada, biz çok Pensilvanya jel içindeki hücre kültürü yüzeye yakın bir odak düzlemine mikron çaplı floresan boncuk alt-mikron sınırlamak için bir yöntem geliştirmek. Bir jel, genellikle, iki cam levha arasında polimerize edilmemiş sıvı jel çözeltisi sandöviç muamele edilmektedir. Jel şiddetle bağlıdır, böylece plakaların bir işlevlendirilmektedir. Diğer fonksiyonelleştirilmemiş ve jel sertleşmeden sonra çıkartılır. Biz bu çıkarılabilir cam su değiştirmekboncuklar bir tabaka ile kaplamak suretiyle rface. Fonksiyonalize ve boncuk kaplı cam yüzeyi arasındaki sıvı jel sandviçleyerek sonra, jel boncukları transfer işleminin sertleştirme sırasında. Bu yüzey 1.6 um olan jel içine Tanelerin entegrasyon mesafeyi sınırlar. Cam alt Petri kapları jel tedavi edildiği yapışık yüzeyi olarak kullanılır. Polimerizasyon sırasında düz bir üst yüzey jel oluşturmak için, bir dairesel cam lamel sandviç etmek için, cam alt-Petri kabı ile jel kullanılır. Jel üretiminden önce, üst cam kapak kayma bir yüzey yükü, sonuçta poli-D-lisin (PDL) ile kaplanır. PDL basınçlı hava ile üflenerek uzaklaştırıldı edilir ve su içinde boncuk çözeltisi kapak slipleri üzerinde bırakılır. Bu, negatif bir yük taşıyan karboksile floresan, mikro-boncuklar, uygulanması ve PDL ile işlenerek oluşturulan pozitif yüklü yüzey ile etkileşime girer. Basınçlı hava, tek bir tabaka ile lamel kapalı boncuk çözeltisi üfleme sonraboncuklar elektrostatik kuru kapak kayma birleştiğinde kalır. Cam slaytlar, hasarsız ve tamamen sağlam PA jelden çıkarıldı olarak PDL kaplama, jel yüzeyine camın yapışkanlığını etkilemez.
Cam alt Petri kutuları 97% 3-aminopropil-trimethoxysliane ve% 0.5 glutaraldehid ile işlenerek yapışkan yapılır. İstenen katılıklarının Pensilvanya jeller standart bir prosedür ile 9 bisakrilamid akrilamid uygun konsantrasyonlarda karıştırılmasıyla oluşturulur. Jel çözeltisinin bir damlacık cam alt Petri kabı üzerine pipetlenir. Boncuklar ihtiva eden bir cam kapak kılıfı sandviç etmek için Petri kabı ile jel kullanılır. Jel tedavi edildiğinde, üst kapak kayma yüzeyinden 1.6 um olan PA jel gömülü boncuk bırakarak kaldırılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu teknik kullanıldığında, bu çözelti, uygun şekilde seyreltilmiş boncuk ve tanecikler arzu edilen çapına göre seçilir esastır, Pensilvanya jel tabaka sertliği ve arzu edilen deneyde incelenmektedir fenomenlerin boyut ölçeği.
Üst cam kapak slipi üzerinde karıştırılmıştır fonksiyonalize önce boncuk seyreltilmesi zaman dikkatli alınmalıdır. Jel yüzeyinde halkalar arasında aralık koloit çözelti seyreltme faktörü değiştirerek değiştirilebilir. Çok fazla …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Disiplinlerarası İnovasyon Girişimi Programı, Illinois Üniversitesi kabul etmek istiyorum, 12.035 hibe. SK Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Hibe dan UIUC finanse edildi 0965918 IGERT: Hücresel ve Moleküler Mekaniği ve Biyonanoteknoloji içinde Araştırmacıları Nesil eğitilmesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Reagents | ||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 |
| 1M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 |
| 0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 |
| Fibronectin, Human, 1mg | BD Biosciences | 354008 |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 161-0700 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 |
| .05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 |
| NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Acrylic Acid | Sigma-Aldrich | 147230 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 |
| Materials | ||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 |
References
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , (2010).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -. A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
- Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic, M. L., Smith, A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , 16 (2010).
- Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
- Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
- Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
- Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).
- Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
- Atanackovic, T., Guran, A. . Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , (2000).
