Murino Endoscopia para<em> In Vivo</em> Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação
Summary
Pequenas técnicas de imagem animais permitem exames de diagnóstico de série e intervenções terapêuticas in vivo. Recentemente, o leque de aplicações tem aumentado significativamente e atualmente inclui avaliação do desenvolvimento de tumor do cólon, cicatrização de feridas e monitoramento da inflamação. Este protocolo ilustra essas aplicações potenciais diferentes de endoscopia murino.
Abstract
Modelos de mouse são amplamente utilizados para estudar patogênese de doenças humanas e para avaliar os procedimentos de diagnóstico, bem como intervenções terapêuticas pré-clínicos. No entanto, a avaliação válida de alterações patológicas, muitas vezes requer análise histológica, e quando realizado ex vivo, necessita de morte do animal. Portanto, em situações experimentais convencionais, exames de acompanhamento intra-individuais são raramente possível. Assim, o desenvolvimento de endoscopia de murino em ratinhos vivos investigadores permite pela primeira vez a ambos visualizar diretamente a mucosa gastrointestinal e também repetir o processo para a monitorização de alterações. Existem inúmeras aplicações para in vivo murino endoscopia, incluindo estudar inflamação intestinal ou cicatrização de feridas, a obtenção de biópsias da mucosa repetidamente, e localmente administrar agentes de diagnóstico ou terapêuticos em uso de cateter de injeção em miniatura. Mo de diagnóstico por imagem, mais recentemente, a imagem molecular tem estendidodalidades permitindo a detecção específica de moléculas alvo específicas distintas, usando as fotossondas. Em conclusão, a endoscopia murino surgiu como uma nova tecnologia de ponta para o diagnóstico experimental in vivo de imagens e pode ter um impacto significativo em pesquisas pré-clínicas em vários campos.
Introduction
Modelos animais têm muito enriquecido nossa compreensão de inúmeras patologias intestinais. O rato de laboratório (Mus musculus) surgiu como um modelo animal primordial na investigação biomédica devido à sua informação genética e genômica abundante e está prontamente disponível em linhagens transgênicas e mata-mata. Além de reforçar a compreensão patogênese da doença, modelos animais também são usados principalmente para testar drogas candidatos, bem como intervenções diagnósticas ou terapêuticas pré-clínicos. No entanto, apesar da variedade de modelos de ratos, simulando a doença humana, muitas opções de diagnóstico e de intervenção que são rotineiramente usados no tratamento do paciente não estão disponíveis para os ratos. Deste modo, as estratégias de vigilância para controlar o curso da doença de murino ou o efeito de intervenções terapêuticas são geralmente limitados para observações indirectas ou post mortem análises. Embora existam procedimentos não-invasivos para os ratos de monitoramento vitalidade como índices de atividade da doença, quantification de perda de peso ou ganho, sangue, urina e fezes análises, estas são apenas indicadores indiretos e são influenciados pela variabilidade inter-individual. Além disso, análises post mortem evitar observações longitudinais em momentos repetitivos. Técnicas de imagem sofisticados para monitorar a atividade da doença em camundongos só recentemente foram introduzidos 1,2. Embora essas técnicas de imagem permitem análises repetitivas, eles apenas fornecem uma visão descritiva e muitas vezes imprecisas sobre o intestino, não permitir a visualização da mucosa direta ou permitir intervenções diagnósticas ou terapêuticas, como a aquisição de biópsia ou aplicação tópica e intramucosal de candidatos a fármacos.
Recentemente, os sistemas de endoscopia de alta resolução para utilização em ratos vivos foram desenvolvidos 3,4. Pela primeira vez, essas técnicas endoscópicas permitir a visualização direta de patologias de doenças do cólon endoluminal como cicatrização de feridas ou inflamação intestinal proporcionando objective estado, em tempo real, permitindo estudos longitudinais no mesmo animal em intervalos de tempo repetitivos. Além de permitir que as biópsias repetidas em um ratinho individual, sistemas de endoscopia também pode ser utilizado para influenciar terapeuticamente um tumor distinta ou inflamação localizada, permitindo a aplicação directa de uma substância para a área de interesse. Além disso, como substâncias terapêuticas e de controlo podem ser entregues directamente para a área de interesse, esta pode ser realizada no mesmo ratinho, não incluindo a variabilidade inter-individual. Estes sistemas de terem sido utilizadas para a avaliação da inflamação do cólon, cicatrização de feridas, biópsias hepáticas laparoscópicas e indução ortotópico de tumores hepáticos 8 e desenvolvimento do tumor através de vários sistemas de pontuação, tais como o índice endoscópica murino de gravidade da colite (MEICS) 5-7. MEICS consiste de cinco parâmetros para avaliar a inflamação: espessamento da parede do cólon, alterações do padrão vascular, presença de fibrina, a granularidade dos Mucossuperfície al, e fezes de consistência.
Neste protocolo, descrevem o uso de endoscopia rígida em modelos murinos de cicatrização intestinal, inflamação e câncer de cólon. Em primeiro lugar, demonstrar a avaliação endoscópica da cicatrização e inflamação do cólon, bem como a avaliação longitudinal da atividade colite eo estudo da cancerogenesis no cólon murino. Além do uso descritivo da endoscopia murino, nós fornecemos instruções detalhadas sobre o uso de instrumentos endoscópicos para obter biópsias, bem como a aplicação tópica e intramucosal de diferentes componentes de interesse (por exemplo, candidatos a fármacos ou células tumorais). Finalmente, demonstramos a utilização de endoscopia fluorescência murino, que emprega técnicas sofisticadas de imagens moleculares, na definição de tumores colo-rectais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cicatrização do epitélio é um processo contínuo. Esfoliação fisiológica contínua de células superficiais da mucosa gastrointestinal ocorre exigindo a regeneração frequente de células epiteliais 16. Consequentemente, a cicatrização de feridas prejudicada tem um imenso impacto sobre várias doenças, incluindo úlceras gastrointestinais e vazamento da anastomose 17 18. Avaliação da base molecular, assim como potenciais candidatos a medicamentos para estimular a cicatrização, só po…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Sonja Dufentester e Elke Weber para assistência técnica especializada. Agradecemos Faekah Gohar pela revisão do manuscrito e Stefan Brückner para suporte informática médica. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa interdisciplinar do Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da Faculdade de Medicina da Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner foi apoiado por uma "Gerok" posição de rotação da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8). Agradecemos Heike Blum para ilustração do desenho animado mouse.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comment |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)–dextrane | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | FD4-250MG | |
| Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| Isopentane (2- Methylbutane) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Omnican F – canula | Braun, Melsungen, Germany | 9161502 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| Equipment | |||
| AIDA Control | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 096020 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 716/40 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 809/81 | |
| Biopsy Forceps, 3 Fr., 28cm | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61071ZJ | |
| Dell Monitor | Dell, Frankfurt am Main, Germany | U2412Mb | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029D | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029C | |
| Fiber Optic Light Cable, 3.5mm | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69495NL | |
| Fluorescein Blue Filter System | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100032 | |
| Fluorescein Barrier Filter | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100033 | |
| Foot switch | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20010430 | |
| HOPKINS Telescope, 1.9mm, Length 10cm | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 1830231 | |
| SCB D-light P | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 133720 | |
| SCB tricam SL II | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 2230 20 | |
| Tubing set instruments VETPUMP II | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69811 | |
| Tricam PDD PAL | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20221037 | |
| UniVet Porta | Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Germany | BKGM 0451 | |
| Vetpump 2 | Karl Storz – Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69321620 |
References
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