Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

Summary

Descriviamo le procedure per l'etichettatura e la genotipizzazione topi appena nati e di generare colture neuronali primarie da loro. La genotipizzazione è rapido, efficiente ed affidabile, e consente l'estrazione automatica acidonucleico. Ciò è particolarmente utile per i mouse neonatale letali e le loro culture, che richiedono la preventiva realizzazione di genotipizzazione.

Abstract

Analisi ad alta risoluzione della morfologia e funzione dei neuroni di mammifero richiede spesso la genotipizzazione dei singoli animali seguita dall'analisi di colture primarie di neuroni. Descriviamo una serie di procedure per: etichettatura topi appena nati per essere sottoposti a genotipizzazione, rapida genotipizzazione, e stabilire le culture a bassa densità di neuroni del cervello di questi topi. Topi individuali sono etichettati da tatuaggio, che permette l'identificazione a lungo termine della durata in età adulta. La genotipizzazione del protocollo descritto è veloce ed efficiente, e consente l'estrazione automatica di acidi nucleici con buona affidabilità. Ciò è utile in circostanze in cui il tempo sufficiente per la genotipizzazione convenzionale non è disponibile, per esempio, in topi che soffrono di letalità neonatale. Colture neuronali primarie sono generati a bassa densità, che permette esperimenti di imaging ad alta risoluzione spaziale. Questo metodo di coltura richiede la preparazione di strati di alimentazione gliali prima placcatura neuronale. Il pROTOCOLLO è applicata nella sua interezza ad un modello murino della distonia disturbo del movimento DYT1 (AE-torsinA topi knock-in), e colture neuronali sono preparati dal ippocampo, corteccia cerebrale e striato di questi topi. Questo protocollo può essere applicato a topi con altre mutazioni genetiche, nonché di altre specie animali. Inoltre, i singoli componenti del protocollo possono essere utilizzati per isolati sotto-progetti. Così questo protocollo avrà applicazioni larghe, non solo nel campo delle neuroscienze, ma anche in altri settori delle scienze biologiche e mediche.

Introduction

Modelli di roditori di malattie genetiche sono dimostrati utili per stabilire le funzioni fisiologiche di proteine ​​normali e acidi nucleici, così come le conseguenze fisiopatologiche di difetti di questi. Gli esempi includono topi deficienti per proteine ​​coinvolte in funzioni cellulari chiave, così come i modelli murini di malattie come il morbo di Alzheimer. Tuttavia, alcune manipolazioni genetiche possono portare a letalità neonatale poco o pochi giorni dopo la nascita. In questi casi, colture primarie sono uno strumento importante perché le cellule vive sono disponibili presso i cuccioli embrionali o neonatali prima della morte, possono essere mantenute per almeno un paio di settimane in vitro, e in questo periodo precoce dello sviluppo neuronale può essere seguito da esperimenti biochimici, funzionali e morfologiche. Per le colture primarie, può essere utile al piatto i neuroni a bassa densità; ciò rende possibile visualizzare il somata individuale, dendriti, alberi assonale e nervo Termisegnali ad alta risoluzione spaziale. Tuttavia, la sopravvivenza e la differenziazione dei neuroni a bassa densità richiede tipicamente che sono piastrate su uno strato alimentatore gliali, co-coltura con cellule gliali in assenza di contatto fisico con loro, o coltivati ​​in terreno condizionato dalla glia ^1.

La creazione di colture neuronali bassa densità su strati di alimentazione gliali può dipendere genotipizzazione veloce e affidabile anticipo – entro poche ore a differenza di alcuni giorni. La velocità è particolarmente importante quando il genotipo neuronale deve essere abbinato a quello di uno strato alimentatore gliali preparato. Come esempio più pratico, può essere necessario decidere quali cuccioli di genotipo che da utilizzare nelle culture generano, per ottimizzare l'efficienza di un esperimento.

Qui mostriamo il protocollo di lavoro che è stato usato per un veloce, semplificato e affidabile genotipizzazione del mouse in precedenti pubblicazioni ^2-6. Mouse e codeun kit disponibile in commercio vengono utilizzati. Questo protocollo comprende un'unica fase di estrazione degli acidi nucleici dal tessuto, e non richiede né una purificazione passo-acido nucleico, né l'uso di un tampone di terminazione ('fermata soluzione'). L'affidabilità di questo metodo genotipizzazione è illustrato presentando i risultati di una serie di prove in cui le differenze sono introdotte rispetto alla quantità iniziale di campioni, l'età degli animali e la lunghezza degli ampliconi PCR. Questo kit offre i vantaggi di estrazione e affidabilità automatizzato.

Per motivi di essere completa, l'uso di tatuaggi per l'identificazione a lungo termine dei topi genotipizzati è anche dimostrato. Il tatuaggio viene ottenuto applicando inchiostro tatuaggio al derma della pelle (sotto l'epidermide) ^7. Una procedura è descritta per tatuaggi i cuscinetti delle zampe di topi neonati o di 1 giorno, anche se tatuaggi possono essere applicati ad altre parti del corpo, come code e dei piedi, e Animals di tutte le età. Inoltre, sarà dimostrato procedure per la placcatura e coltivando neuroni di topo a bassa densità, basato sulla preparazione ottimale di diversi tipi di strati di alimentazione gliali ^2,8.

Usiamo un modello genetico del mouse della malattia neurologica ereditaria DYT1 distonia – una malattia autosomica dominante movimento causata da una mutazione nel gene TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) ^9. La proteina codificata, torsinA, appartiene alle "ATPases associati alle diverse attività cellulari" (AAA +) famiglia di proteine, i cui membri generalmente eseguire funzioni chaperone-like, che assiste in: proteine ​​unfolding, proteina-complesso smontaggio, il traffico di membrana, e la fusione delle vescicole ^10-13. I risultati mutazione in un in-frame delezione di un codone dell'acido glutammico, e possono portare alla manifestazione di 'insorgenza precoce generalizzata isolato distonia' ^14,15. Tuttavia, il percorsomeccanismi ophysiological responsabili di questo disturbo rimangono poco conosciuti. In un modello di topo knock-in, l'allele mutante è TOR1A ^tm2Wtd, citato qui di seguito come TOR1A ^AE. Eterozigoti AE-torsinA knock-nei topi sono pazienti umani vitali e geneticamente mimici con DYT1 distonia, mentre omozigote knock-in topi muoiono dopo la nascita ^16,17, con la latenza di morte post-natale colpiti da background genetico ^18. La morte precoce di omozigoti topi knock-in richiede che sia la genotipizzazione degli animali e la creazione di colture neuronali sono concluse rapidamente. Come altro esempio di genotipizzazione, Tfap2a (fattore di trascrizione AP-2α, attivando legame con le proteine ​​2α enhancer) sarà utilizzato. La proteina codificata da questo gene è importante nella regolazione più processi cellulari, quali la proliferazione, la differenziazione, la sopravvivenza e apoptosi ^19.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure sugli animali eseguiti in questo studio sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale della University of Iowa. Identificazione 1. a lungo termine di topi mediante tatuaggio dei cuscinetti delle zampe Immobilizzare una zampa con il pad della zampa (superficie plantare) rivolta verso lo sperimentatore. Tenere la zampa con il pollice e il dito indice. Fare attenzione a non schiacciare la zampa. NOTA: l'immobilizz…

Representative Results

Come esempio di applicazione di questo protocollo, risultati rappresentativi sono mostrati per etichettare topi tatuaggi, genotipizzazione affidabile in varie condizioni sperimentali, e stabilendo colture neuronali primarie su strati di alimentazione gliali. Tatuaggio Cuccioli appena nati sono stati etichettati sui cuscinetti delle zampe utilizzando un sistema tatuaggi ('Newborn' in Figura 1). Le etichette sono rimasti ch…

Discussion

Il protocollo presentato qui comprende procedure per tatuaggi per etichettare / individuare i topi, per la genotipizzazione topi da punte di coda, e per la coltura neuroni del cervello del mouse a bassa densità. In un giro di esperimenti usando 6-8 cuccioli, queste procedure richiedono tipicamente ~ 0,5 ore, ~ 4 ore e ~ 2 ore, rispettivamente, per un totale di 6-7 ore. Questo rende pratico per un singolo sperimentatore per completare tutte le procedure necessarie dal momento della nascita i cuccioli 'del fasciame d…

Materials

REAGENTS – tattooing
Machine Cleanser	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NMCR3	This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NDAR4	This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NBP01
Skin Prep Applicator	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSPA1	Q-tip.
Skin Prep solution	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSP01	This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS – genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)	EZ BioResearch LLC	G2001-100
2X PCR Ready Mix II	EZ BioResearch LLC	G2001-100	A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial	VWR	BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade	rpi	A20090-500	We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)	Fisher	BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl	Dot Scientific Inc	UG104-96RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl	Dot Scientific Inc	UG2020-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl	Dot Scientific Inc	UG2812-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp	EZ BioResearch LLC	L1001	We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp	EZ BioResearch LLC	L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder	GIBCO-Invitrogen	10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml	USA Scientific	1402-2900	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual	rpi	145660	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural	USA Scientific	1605-0000	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO	GIBCO-Invitrogen	S33102
Tris base	rpi	T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice			5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice			5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS – cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503-100MG	See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement	GIBCO-Invitrogen	17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated	BD falcon	353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml	BD falcon	353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml	BD falcon	353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml	BD falcon	352095
Countess (cell number counter) chamber slides	GIBCO-Invitrogen	C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)	Sigma-Aldrich	C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm	Pyrex	3160-101
Distilled water	GIBCO-Invitrogen	15230-147
DNase Type II	Sigma-Aldrich	D4527-200KU	Stock solution is prepared at 1500 units/20 μl = 75000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	GIBCO-Invitrogen	10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	569-0020
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO-Invitrogen	26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0	Carolina	633017
GlutaMAX-I	GIBCO-Invitrogen	35050-061
Hanks' Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent	Sigma-Aldrich	258148-100 ML
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)	Sigma-Aldrich	63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free	BD Biosciences	356237	This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20°C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4°C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO-Invitrogen	51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml	BD Biosciences	355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate	BD falcon	353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate	BD falcon	353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid	GIBCO-Invitrogen	10888-022
Nitric Acid	VWR	bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21	prepared in the lab		Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”	Fisher	13-678-6A	Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”	Fisher	13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Serological pipet, 2 ml	BD falcon	357507
Serological pipet, 5 ml	BD falcon	357543
Serological pipet, 10 ml	BD falcon	357551
Serological pipet, 25 ml	BD falcon	357525
Serological pipet, 50 ml	BD falcon	357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis	Sigma-Aldrich	480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich	Sigma-Aldrich	431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm	Corning	431219
Syringe, 3 ml	BD falcon	309585
Transferrin, Holo, bovine plasma	Calbiochem	616420
Trypan Blue stain, 0.4%	GIBCO-Invitrogen	T10282	This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI	Sigma-Aldrich	T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%	GIBCO-Invitrogen	25200-056
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003-5G	Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS – immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2	Merck Millipore	AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail	Merck Millipore	NE1015