Bestilling enkelte celler og Single Embryoner i 3D Indespærring: En ny enhed for High Content Screening
Summary
Vi rapporterer en indretning og en ny metode til at studere celler og embryoner. Enkelte celler er præcist bestilles i microcavity arrays. Deres 3D indespærring er et skridt i retning 3D-miljøer er stødt på i fysiologiske forhold og tillader organel orientering. Ved at styre celleform, denne opsætning minimerer variation rapporteret i standard assays.
Abstract
Biologiske celler er sædvanligvis observeres på flade (2D) overflader. Denne betingelse er ikke fysiologisk, og fænotyper og former er meget varierende. Screening baseret på celler i sådanne miljøer har derfor alvorlige begrænsninger: celle organeller viser ekstreme fænotyper, celle morfologier og størrelser er heterogene og / eller specifikke celle organeller kan ikke sigtes ordentligt. Desuden er celler in vivo beliggende i et 3D-miljø; i denne situation, celler udviser forskellige fænotyper primært på grund af deres interaktion med det omgivende ekstracellulære matrix af vævet. For at standardisere og generere orden af enkelte celler i en fysiologisk relevant 3D-miljø for cellebaserede assays, rapporterer vi her den mikrofabrikation og applikationer af en anordning til in vitro-3D cellekultur. Denne anordning består af en 2D array af mikrohulrum (typisk 10 5 kaviteter / cm2), hver fyldt med enkelte celler eller embryoner. Cell position, form, polaritet og intern celle organisation bliver derefter normaliseret viser en 3D arkitektur. Vi brugte replika støbning til mønster en række mikrokaviteter, 'æggebægre', på en tynd polydimethylsiloxan (PDMS) lag klæbet på et dækglas. Hulrum var dækket med fibronectin til lette adhæsion. Celler blev indsat ved centrifugering. Påfyldning procentdel blev optimeret til hvert system giver mulighed for op til 80%. Celler og embryoner levedygtighed blev bekræftet. Vi anvendte denne metode til visualisering af cellulære organeller, såsom nucleus og Golgi apparatet, og til at studere aktive processer, såsom lukningen af cytokinetic ring under cellemitose. Denne enhed tillod identifikation af nye funktioner, såsom periodiske ophobninger og inhomogeniteter af myosin og actin under cytokinetic ring lukning og komprimerede fænotyper for Golgi og nucleus tilpasning. Vi kendetegnet metoden for pattedyrceller, fission gær, spirende gær, C. elegans wed specifikke tilpasning i hvert enkelt tilfælde. Endelig karakteristika denne enhed gør det særligt interessant for lægemiddelscreeningsassays og personlig medicin.
Introduction
Nuværende in vitro cellebaserede assays er todimensionale (2D). Denne konfiguration er ikke naturligt for pattedyrsceller og er derfor ikke fysiologisk relevant 1; celler udviser en mangfoldighed af former, størrelser og heterogene fænotyper. De præsenterer yderligere alvorlige begrænsninger ved påføring på screening applikationer, såsom en uordnet fordeling inden for planet og ekstreme fænotyper af cellulære organeller (stress fibre, i særdeleshed). Dette er særlig vigtigt i kliniske forsøg for narkotika testning, hvor høje budgetter hvert år bruges. De fleste af disse lægemidler imidlertid mislykkes, når anvendt på dyremodeller på grund af den kunstige 2D dyrkningsbetingelser i tidlige stadier af lægemiddelscreening. Ved at bruge denne fremgangsmåde, specifikke celleorganeller kan ikke sigtes ordentligt, såsom cytokinetic actomyosin ring under cellemitose, og generelt strukturer, der udvikles på planet vinkelret på planet for observation. Noglenye 2D assays er blevet foreslået for at overvinde de ovennævnte ulemper og vigtige indsigt på cytoskeleton organisation er observeret 2,3. Men disse assays stadig findes en alvorlig begrænsning,: celler viser en meget spredt fænotype i modsætning til hvad der observeres in vivo, hvor cellerne udgør en 3D arkitektur. Disse artefakter forbundet med kulturen metoden kan udløse ikke-fysiologiske funktioner såsom forbedrede stress fibre 1,4,5.
Tredimensionale celledyrkningsassays giver flere fordele i sammenligning med 2D miljøer 6,7. De er fysiologisk mere relevant, og resultaterne er derfor meningsfuldt. Som et eksempel, celler indlejret i hydrogeler viser 3D-lignende strukturer, men deres morfologier forskellige fra én celle til en anden 8,9. Men deres morfologier forskellige fra én celle til en anden, hvilket komplicerer screening applikationer. En alternativ strategi er at indlejre enkeltceller i mikrofabrikerede hulrum 10,11. Cell position, form, polaritet og intern celle organisation kan så blive normaliseret. Ud over at give 3D-lignende arkitektur til celler, mikrokaviteter giver også mulighed for høj-indhold screeningsundersøgelser 10,12-14; enkeltceller kan bestilles i microarrays og cellulære organeller og kan iagttages deres udviklingstendenser parallelt. Denne regelmæssighed giver god statistik med lavt antal celler og bedre tidsmæssige / rumlige opløsninger. Anvendelige forbindelser er nemmere at identificere pålideligt.
I denne undersøgelse, viser vi fremstilling og anvendelse af en ny 3D-lignende enkelt celler kultur for højt indhold-screening applikationer 10,12,13. Enheden består af en vifte af elastomere mikrokaviteter (10 5 hulrum / cm2), opfundet 'Æggebægre «(EF). Dimensioner og samlede volumen af EF i dette arbejde er optimeret til den typiske mængde af individuelle NIH3T3 og HeLa-cellerunder celledeling. Morfologi af hulrummene – cylindriske – er valgt til korrekt orientere celleform til visualisering af aktive processer. Replika støbning anvendes til pattern et array af EF på en tynd polydimethylsiloxan (PDMS) lag klæbet på et dækglas 15,16. Celler indført i EF ved centrifugering. Vi rapporterer her observation og normalisering af cellulære organeller (actin stress fibre, Golgi apparater og nucleus) i 3D (EF) sammenlignet med de samme celler på 2D (flad) overflader. Vi rapporterer også observation af aktive dynamiske processer, såsom lukning af cytokinetic actomyosin ring under celle mitose 17. Endelig viser vi resultaterne af denne metode på andre systemer med stive vægge, såsom knopskydende gær, fission gær og C. elegans-embryoer hvilket bekræfter anvendeligheden af vores metodologi til en lang række modelsystemer.
Vi næste fremlægge en detaljeret og udtømmende protokol for at fremstille og anvende 'æggebægre' til 3D mikrofabrikation. Vores tilgang er enkel og behøver ikke et rent lokale. Vi forventer, at denne nye metode vil være særlig interessant for lægemiddelscreeningsassays og personlig medicin, i stedet for petriskåle. Endelig vil vores enhed være nyttige til undersøgelse af fordelinger af celler reaktioner på eksterne stimuli, for eksempel i cancer 18 eller i grundforskning 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Replika støbning blev anvendt for at fremstille de »æggebægre«. Fremstillingsprocessen behøver ikke et rent værelse; det er let og enkelt, selv om der kan være behov nogle praksis. Især frigiver PDMS stempel er den mest kritiske trin for at frembringe et stort område af høj kvalitet 'æggebægre «. Af denne grund, særlig pleje skal tages i dette trin. Hvis dette trin gentagne gange ikke, overveje at optimere plasma renere parametre forud for silaniseringen og plasmabinding. Utilstrækkelig silanisering …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender L. Brino (IGBMC High Content Screening facilitet, Illkirch, Frankrig) for at give os den anti-Giantin antistof, M. Labouesse Lab. for C. elegans (IGBMC) og B. Seraphin Lab. til spirende gær (IGBMC), E. Paluch og A. Hyman for fluorescerende HeLa-celler (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) og JQ Wu (Ohio State University) for fission gærceller; A. Hoel og F. Evenou til eksperimentel hjælp, C. Rick (IBMC, Strasbourg, Frankrig) for teknisk hjælp, og JC Jeannot (Femto-st, Frankrig) om hjælp til mikrofabrikation. Dette arbejde blev støttet af midler fra CNRS, University of Strasbourg, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale og ci-FRC Strasbourg.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
- Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
- Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
- Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
- Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
- Riveline, D., Buguin, A. . Devices and methods for observing the cell division. , (2010).
- Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
- Riveline, D. . Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , (2012).
- Riveline, D., Wollrab, V. . Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , (2012).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
- Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G., Hughes, M. P., Hoettges, K. F. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. 583, 81-107 (2010).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
- Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
- Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
- Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
- Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
- Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
- Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
- Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
- Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
- Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
- Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
- Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).
