Bestilling av enkeltceller og enkelt Embryoet i 3D Confinement: En ny enhet for høyt innhold Screening
Summary
Vi rapporterer en anordning og en ny metode for å studere celler og embryoer. Enkeltceller er nettopp bestilt i microcavity arrays. Deres 3D innesperring er et skritt mot 3D-miljøer oppstått i fysiologiske forhold og lar organelle orientering. Ved å kontrollere celleform, minimerer dette oppsettet variasjonen rapportert i standardtester.
Abstract
Biologiske celler er vanligvis observeres på flate (2D) overflater. Denne tilstanden er ikke fysiologisk, og fenotyper og former er svært variabel. Screening basert på celler i slike miljøer har derfor alvorlige begrensninger: celleorgan viser ekstreme fenotyper, celle morfologi og størrelser er heterogene og / eller spesifikke celleorganeller kan ikke være riktig visualisert. I tillegg er celler in vivo som ligger i et 3D-miljø; i denne situasjon, vil celler viser forskjellige fenotyper hovedsakelig på grunn av deres interaksjon med det omgivende ekstracellulær matriks av vevet. For å standardisere og generere ordre av enkeltceller i et fysiologisk relevant 3D-miljø for cellebaserte analyser, rapporterer vi her den microfabrication og anvendelser av en anordning for in vitro-3D-cellekultur. Denne anordning består av en 2D-matrise av mikrohulrom (typisk 10 5 hulrom / cm 2), hver fylt med enkle celler eller embryoer. Cell posisjon, form, polaritet og intern celle organisasjon blir deretter normalisert viser en 3D-arkitektur. Vi brukte replica molding til mønsteret en rekke mikrohulrom, 'eggcups', mot en tynn polydimethylsiloxane (PDMS) sjikt festet på et dekkglass. Hulrom ble dekket med fibronektin å lette adhesjon. Celler ble innsatt ved sentrifugering. Fylling prosent var optimalisert for hvert system som tillater opp til 80%. Celler og embryoer levedyktighet ble bekreftet. Vi har anvendt denne metode for visualisering av cellulære organeller, slik som nucleus og Golgi-apparatet, og for å studere aktive prosesser, slik som lukking av cytokinetic ringen under celle mitose. Denne enheten tillot identifisering av nye funksjoner, for eksempel periodiske ansamlinger og inhomogeniteter av myosin og aktin under cytokinetic ring nedleggelse og kompakt fenotyper for Golgi og kjernen justering. Vi karakteriserte fremgangsmåte for pattedyrceller, gjær, spalting spirende gjær, C. elegans with spesifikk tilpasning i hvert enkelt tilfelle. Til slutt, hva som kjennetegner denne enheten gjør den spesielt interessant for narkotika screening-analyser og personlig medisin.
Introduction
Current in vitro celle-baserte analyser er to-dimensjonale (2D). Denne konfigurasjonen er ikke naturlig for pattedyrceller, og derfor er ikke fysiologisk relevant 1; celler viser et mangfold av former, størrelser og heterogene fenotyper. De presenterer flere alvorlige begrensninger når den brukes til screening applikasjoner, slik som en uordnet fordeling innenfor planet og ekstreme fenotyper av cellulære organeller (stress-fibre, spesielt). Dette er spesielt viktig i kliniske studier for narkotika testing, der høye budsjetter er brukt hvert år. De fleste av disse stoffene selv svikter når den anvendes på dyremodeller på grunn av den kunstige 2D kulturen tilstand i tidlige stadier av legemiddelscreening. I tillegg, ved å bruke denne tilnærmingen, spesifikke celleorganeller kan ikke være riktig visualisert, slik som cytokinetic actomyosin ring under celle mitose, og generelt strukturer som er under utvikling i planet vinkelrett på planet for observasjon. Noennye 2D-analyser er blitt foreslått for å overvinne de ovennevnte ulemper og viktige innsikter for cytoskjelettet organisasjon har blitt observert 2,3. Men disse analysene fortsatt er tilstede en alvorlig begrensning:-celler viser en meget spredt fenotype i motsetning til hva som er observert in vivo, hvor celler som presenterer en 3D-arkitektur. Disse gjenstander knyttet til kultur metoden kan utløse ikke-fysiologiske funksjoner som forbedret stresset fiber 1,4,5.
Tredimensjonal cellekulturanalyser gir flere fordeler sammenlignet med 2D-miljøer 6,7. De er fysiologisk mer relevant, og resultatene er derfor meningsfylt. Som et eksempel kan celler som er innleiret i hydrogeler vise 3D-lignende strukturer, men deres morfologi avvike fra en celle til en annen 8,9. Men deres morfologi avvike fra en celle til en annen, noe som kompliserer screening applikasjoner. En alternativ strategi er å legge ned enkeltceller i microfabricated hulrom 10,11. Cell posisjon, form, polaritet og intern celle organisasjon kan da bli normalisert. Foruten 3D-lignende arkitektur til celler, mikrohulrom gir også mulighet for høy innhold screeningstudier 10,12-14; enkeltceller kan bestilles til mikromatriser og cellulære organeller og deres videreutviklinger kan observeres i parallell. Denne regularitet gir god statistikk med lavt antall celler og bedre time / romlig oppløsning. Nyttige forbindelser er enklere å identifisere en pålitelig måte.
I denne studien viser vi fremstillingen og anvendelse av en ny 3D-lignende enkeltceller kultursystem for høyt innhold-screening applikasjoner 10,12,13. Enheten består av en rekke elastiske mikrohulrom (10 5 hulrom / cm 2), som ble skapt 'eggcups' (EF) nr. Mål og totalvolumet av EU i dette arbeidet er optimalisert til den typiske volum av individuelle NIH3T3 og HeLa-cellerunder celledeling. Morfologi av hulrommene – sylindriske – er valgt å riktig orientere celleform for visualisering av aktive prosesser. Replika støping brukes for å mønster en oppstilling av EC på en tynn polydimetylsiloksan (PDMS) sjikt klebet på et dekkglass 15,16. Celler blir innført i EF ved sentrifugering. Vi rapporterer her observasjon og normalisering av cellulære organeller (aktin spennings fibre, Golgi-apparatet og nucleus) i 3D (EC) sammenlignet med de samme celler på 2D (flat) overflater. Vi rapporterer også observasjon av aktive dynamiske prosesser som for eksempel stenging av cytokinetic actomyosin ring under celle mitose 17. Til slutt viser vi Resultatene av denne metoden for andre systemer med stive vegger, slik som spirende gjær, gjær og fisjons C. elegans embryoer som bekrefter anvendeligheten av vår metode for et bredt spekter av modellsystemer.
Vi neste presentere en detaljert og uttømmende protocol for å dikte og anvende 'eggcups "for 3D microfabrication. Vår tilnærming er enkel og trenger ikke et rent rom. Vi forventer at denne nye metodikken vil være spesielt interessant for narkotika screening-analyser og personlig medisin, til erstatning for petriskåler. Til slutt vil vår enhet kan være nyttige for å studere fordelingen av cellene respons på ytre stimuli, for eksempel i kreft 18 eller i 19 grunnleggende forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Replika støping ble anvendt for å fremstille 'eggcups'. Fabrikasjon prosessen trenger ikke et rent rom; det er lett og enkelt, selv om noen praksis kan være nødvendig. Spesielt frigjøring av PDMS stempel er den mest kritiske trinnet for å fremstille et stort område av høy kvalitet 'eggcups'. Av denne grunn må tas i dette trinnet spesiell omsorg. Hvis dette trinnet er gjentatte ganger mislykkes, kan du vurdere å optimalisere plasma renere parametere før den silanisering og plasma bindende. Util…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkjenner L. Brino (IGBMC høyt innhold Screening anlegget, Illkirch, Frankrike) for å gi oss med anti-Giantin antistoff, M. Labouesse Lab. for C. elegans (IGBMC) og B. Séraphin Lab. for spirende gjær (IGBMC), E. Paluch og A. Hyman for fluorescerende HeLa celler (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) og JQ Wu (Ohio State University) for fisjon gjærceller; A. Hoel og F. EVENOU for eksperimentell hjelp, C. Rick (IBMC, Strasbourg, Frankrike) for teknisk hjelp, og JC Jeannot (Femto-st, Frankrike) for å få hjelp i microfabrication. Dette arbeidet ble støttet av midler fra CNRS, Universitetet i Strasbourg, Conectus, La Fondation pour la Recherche MEDICALE og ci-FRC fra Strasbourg.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
- Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
- Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
- Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
- Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
- Riveline, D., Buguin, A. . Devices and methods for observing the cell division. , (2010).
- Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
- Riveline, D. . Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , (2012).
- Riveline, D., Wollrab, V. . Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , (2012).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
- Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G., Hughes, M. P., Hoettges, K. F. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. 583, 81-107 (2010).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
- Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
- Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
- Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
- Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
- Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
- Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
- Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
- Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
- Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
- Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
- Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).
