Fluorescently लेबल कोशिकाओं के मल्टिप्लेक्स छवि आधारित विश्लेषण को सक्षम करने के लिए एक लचीला सूचना विज्ञान कार्यप्रवाह है प्रस्तुत किया। कार्यप्रवाह परमाणु और cytoplasmic मार्करों quantifies और इन डिब्बों के बीच मार्कर स्थानान्तरण गणना करता है। प्रक्रियाएं 96 अच्छी तरह स्वरूपों में अप्रत्यक्ष immunofluorescence द्वारा मार्कर का पता लगाने के लिए siRNA और विश्वसनीय पद्धति का उपयोग कोशिकाओं की गड़बड़ी के लिए प्रदान की जाती हैं।
पक्षपाती स्तनधारी टिशू कल्चर मॉडल में कोशिकाओं के व्यवहार को नियंत्रित करने वाले नियंत्रण तंत्र को समझने के क्षेत्र में अग्रिम एकल कोशिका विश्लेषण के तरीके पर निर्भर होते जा रहे हैं। सेल आबादी से बायोमार्कर का मतलब मूल्यों को दर्शाती समग्र डेटा देने के जो तरीके का अध्ययन जैविक प्रणाली की विविधता को प्रतिबिंबित कि उप-जनसंख्या गतिशीलता खोने का खतरा। इस के साथ रखने में, पारंपरिक तरीकों से प्रतिस्थापित किया जा रहा है, या उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए विकसित सेलुलर परख की है, और अधिक परिष्कृत रूपों के साथ समर्थन किया। ये assays संभावित मालिकाना सॉफ्टवेयर संकुल के साथ द्वारा सक्षम है, जो फ्लोरोसेंट बायोमार्कर, की छवियों की बड़ी संख्या को उत्पन्न, सेल प्रति बहु पैरामीट्रिक मापन के लिए अनुमति देता है। हालांकि, अपेक्षाकृत उच्च पूंजी लागत और इन उपकरणों में से कई की overspecialization कई जांचकर्ताओं के लिए उनकी पहुंच को रोका है।
यहाँ वर्णित एक हैसबसे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से छवियों के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त व्यक्ति की कोशिकाओं के विशिष्ट subcellular क्षेत्रों से कई फ्लोरोसेंट मार्कर तीव्रता की मात्रा का ठहराव के लिए सार्वभौमिक रूप से लागू कार्यप्रवाह। इस कार्यप्रवाह की कुंजी प्रतिदीप्ति मार्कर तीव्रता इन छवियों में व्यक्ति की कोशिकाओं, परिभाषित subcellular क्षेत्रों में खंड उन्हें भेद और वितरित करने के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर एक के कार्यान्वयन के इन क्षेत्रों के लिए विशिष्ट मूल्यों है। छवि डेटा से अलग-अलग सेल तीव्रता मूल्यों की निकासी इस कार्यप्रवाह का केंद्रीय उद्देश्य है और अनुयायी मानव कोशिकाओं में G1 चौकी नियामकों के लिए एक siRNA स्क्रीन से नियंत्रण आंकड़ों के विश्लेषण के साथ सचित्र किया जाएगा। हालांकि, यहां प्रस्तुत कार्यप्रवाह सेल गड़बड़ी के अन्य साधन से डेटा का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, यौगिक स्क्रीन) इस प्रकार और प्रतिदीप्ति आधारित सेलुलर मार्करों के अन्य रूपों और प्रयोगशालाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी होना चाहिए।
यहाँ प्रस्तुत काम व्यक्ति की कोशिकाओं और परिभाषित subcellular क्षेत्रों की पहचान करने के लिए पक्षपाती कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों के एल्गोरिथ्म निर्देशित टूटने प्रदर्शन करने के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर सेल प्रोफाइलर के उपयोग का वर्णन है। छवि विभाजन के रूप में संदर्भित यह दृष्टिकोण, प्रत्येक कोशिका या (के रूप में खंडित वस्तुओं के लिए कहा गया है) subcellular क्षेत्र के लिए स्थानीय fluorescently लेबल मार्करों बढ़ाता ने उतारी कोशिकाओं के बाद बहु पैरामीट्रिक विश्लेषण की अनुमति देता है। इस कार्यप्रवाह उच्च सामग्री विश्लेषण को सक्षम करने के लिए एक आधार का गठन किया है और आगे विकसित और मल्टी पैरामीट्रिक के अनुरूप संशोधित, अलग-अलग सेल विशेष उच्च सामग्री यंत्र या मालिकाना सॉफ्टवेयर के उपयोग के बिना प्रयोगशालाओं में विश्लेषण करती जा सकता है कि एक उपकरण के रूप में सेवा करने का इरादा है। इस पांडुलिपि के साथ आपूर्ति की फाइलों में वर्णित विश्लेषण उत्पन्न करने के लिए प्रासंगिक कच्चे छवि डेटा, एल्गोरिथ्म सेटिंग और समर्थन लिपियों के एक परीक्षण सेट शामिल हैं। प्रदान की एल्गोरिथ्म सेटिंग्स चया सेल प्रोफाइलर निर्धारित उदाहरण डेटा और समायोजन अन्य अध्ययनों से छवि डेटा के उपयोग को सक्षम करने के लिए आवश्यक हो सकता है क्या चर्चा अनुभाग विवरण के लिए अनुकूलित कर रहे हैं।
मात्रात्मक डेटा सेल Profiler का उपयोग निकाला गया है एक बार, अलग प्रयोगशालाओं कच्चे डेटा में अलग-अलग सेल मूल्यों द्वारा प्रस्तुत जानकारी का उपयोग कैसे के लिए विभिन्न आवश्यकताओं को हो सकता; यहाँ दिखाया फाटकों प्रत्येक परख के लिए कच्चे डेटा को लागू कर रहे हैं जिसके द्वारा एक दृष्टिकोण है। इन फाटकों का उपयोग, डेटा गेट्स द्वारा परिभाषित प्रतिक्रिया के दौर से गुजर कोशिकाओं के उप-जनसंख्या के साथ अलग उपचार जोड़ने के रुझान के दृश्य की अनुमति, प्रतिक्रिया के द्विआधारी शर्तों के रूप में तब्दील कर रहे हैं। फाटकों प्रत्येक प्रासंगिक माप के लिए उपयुक्त नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के लिए प्राप्त आंकड़ों वितरण की टिप्पणियों के आधार पर स्थापित कर रहे हैं। फाटक के उपयोग के कच्चे, सेल आधारित माप का प्रबंधन करने के लिए कैसे की सिर्फ एक उदाहरण है। इसके अलावा यहां दिखाए गए परमाणु डीएनए तीव्रता का इस्तेमाल होता है मुझेgated डेटा के साथ संयोजन में मूल्यों का एक निरंतर रेंज के रूप में अपने कच्चे रूप में asurements। छवि विश्लेषण डेटा के प्रबंधन के दृष्टिकोण के लिए अन्य अध्ययन की प्रकृति पर निर्भर करता है, विचार किया जाना चाहिए; उप-जनसंख्या कोशिकाओं बताए के लिए फाटकों का उपयोग करने के लिए सांख्यिकीय विकल्प मापदंडों की बड़ी संख्या तीन सूचित किया गया है भर में उच्च सामग्री डेटा संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए रणनीति के 2 और व्यवस्थित तुलना सूचित किया गया है।
6 – छवि डेटा की उच्च सामग्री का विश्लेषण दवा-प्रतिक्रिया के सेलुलर पढ़ाई में उपयोग मिल गया है, आनुवंशिकी और 4 संकेत पर्यावरण के तनाव को उल्टा। उच्च सामग्री विश्लेषण की योग्यता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी डेटा की एल्गोरिथम विश्लेषण मात्रात्मक और स्थानिक मापदंडों व्यक्ति की कोशिकाओं 7 भर में एक साथ विचार किया जा करने की अनुमति देता है कि इस तथ्य से उपजा है। इस तरह, कई assays के लिए सेलुलर परिणामों परख-डी के पार संदर्भित, अंतर व्यवहार किया जा सकता हैefined सेल उप-जनसंख्या रूपात्मक चर के विचार शामिल कर सकते हैं प्रयोगात्मक शर्तों और assays के भीतर लगाया जा सकता है। रणनीतियों और विश्लेषण कार्यप्रवाह अन्य उच्च सामग्री के दृष्टिकोण के रूप में, व्यक्ति की कोशिकाओं को पार संदर्भित कर रहे हैं कि मल्टिप्लेक्स डेटा देने में सक्षम हैं, यहाँ पर चर्चा की। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप छवियों पैदा करते हैं और छवियों के हजारों के माध्यम से कम throughput के पारंपरिक प्रतिदीप्ति आधारित माइक्रोस्कोपी में उत्पादित छवियों के दसियों से लेकर डेटा का विश्लेषण करने के लिए लागू कर रहे हैं कि उच्च सामग्री के तरीकों सूट पढ़ाई स्वचालित उच्च सामग्री स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों का उपयोग कर उत्पादन किया।
कार्यप्रवाह अलग assays के परमाणु फ्लोरोसेंट मार्कर तीव्रता या क्रमशः एक फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रोटीन के परमाणु / साइटोप्लास्मिक स्थानान्तरण, या तो के संदर्भ में मापा जाता है, जिसमें से उदाहरण डेटा के साथ यहाँ सचित्र है। कार्यप्रवाह इन assays अलग से विचार या संयोजन में पूर्वी वायु कमान के आधार पर किया जा सकता है कि में लचीला हैएच अलग जांचकर्ताओं द्वारा अनुसंधान प्रश्न दिए गए। उदाहरण डेटा एक शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) प्रयोग (चित्रा 1) के हिस्से के रूप में उत्पादित कर रहे हैं। छोटे दखल शाही सेना oligonucleotides (siRNA) cyclin निर्भर काइनेज (CDK) गतिविधि के दो फ्लोरोसेंट पत्रकारों के लिए परिवर्तन में जो परिणाम HCT116 मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा कोशिकाओं में विशिष्ट प्रोटीन पछाड़ना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। सेरीन में परमाणु रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन 780 (पी-S780 RB1) की CDK6 निर्भर फास्फारिलीकरण एंटीबॉडी धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया है। एक ही कोशिकाओं में, CDK2 गतिविधि (GFP-CDK2 संवाददाता) की एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग संवाददाता CDK2 गतिविधि के अभाव में संवाददाता cytoplasm में नाभिक में और CDK2 सक्रियण शटल पर रहता है जहां cytoplasmic अनुपात करने के लिए अपने परमाणु द्वारा मूल्यांकन किया है 8। इसके अलावा, प्रत्येक कोशिका के परमाणु डीएनए एक डीएनए intercalating डाई का उपयोग दाग है, छवियों में नाभिक सीमाओं कोशिकाओं की पहचान और परिभाषित करने के लिए एक साधन के रूप में कार्य करता है जो Bisbenzimide, के रूप में अच्छी तरह से एकडीएनए बहुतायत सेल का सेल चक्र स्थिति के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने के (चित्रा 2) के सा उपाय है।
CDK6 और CDK2 की गतिविधियों सेल चक्र 5 एस चरण के लिए G1 के से कोशिकाओं को पारगमन के रूप में पहचाने जाने हैं और इस तरह, व्यक्ति की कोशिकाओं में दो पत्रकारों के बीच करीब क़बूल की उम्मीद है, के रूप में एक दूसरे को 9,10 सफल और। यहां इस्तेमाल किया प्रदर्शन डाटासेट siRNA के प्रभाव CDK6, रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (RB1) और एक गैर-लक्ष्य नकारात्मक नियंत्रण (तालिका 1) लक्ष्य एक उदाहरण के रूप में विश्लेषण करती है। CDK6 की पछाड़ना पी-S780 RB1 मिलान की कमी आई और सेल चक्र के G1 के चरण में कोशिकाओं का एक संग्रह दोनों को प्रकाश में लाना चाहिए। RB1 पछाड़ना phospho-S780 एंटीबॉडी की विशिष्टता के लिए एक अभिकर्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। Formalin से प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी छवियों fluorescently दाग HCT116 टिशू कल्चर कोशिकाओं एल्गोरिथम छवि विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, 11 तय की। जिसके परिणामस्वरूप संख्यात्मक डेटा तो करने के लिए प्रयोग किया जाता हैपार के संदर्भ पत्रकारों और विभिन्न पछाड़ना राज्यों के प्रभाव गेज।
विश्लेषण के इस प्रकार के द्वारा उत्पादित डेटा के संभावित आकार सामान्य विश्लेषण उपकरणों के लिए एक चुनौती पेश कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, अलग-अलग सेल डेटा कुछ स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर को समायोजित करेगा से भी बड़ा हो सकता है। बड़े डेटासेट के विश्लेषण में सहायता करने के लिए डेटा का सरल, उच्च दोहराव, देखरेख के प्रसंस्करण प्रदर्शन जो पर्ल स्क्रिप्ट शामिल हैं। पर्ल स्क्रिप्ट एक विशिष्ट फ़ाइल नेमिंग कन्वेंशन (चित्रा 3) के साथ छवि फ़ाइलें प्रसंस्करण जब सेल प्रोफाइलर, द्वारा उत्पादित उत्पादन फ़ाइलों के लिए विशेष रूप से लिखा है, और विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा प्रति अच्छी तरह से खेतों की चर संख्या के लिए अनुमति देते हैं। यह सेल उप-जनसंख्या 5 में प्रवृत्तियों को ट्रैक करने के लिए गेट व्यक्तिगत सेल परख डेटा को अक्सर महत्वपूर्ण है और यहाँ दिखाया प्रत्येक परख प्रकार के लिए पूर्व निर्धारित एक सेट गेट के आधार पर प्रत्येक कोशिका ध्वज को एक पर्ल स्क्रिप्ट का इस्तेमाल होता है। इसके अलावा शामिल वैकल्पिक पर्ल स्क्रिप्ट कर रहे हैंजो व्यक्ति कुओं (या शर्तों) के लिए डेटा परिणाम को संक्षेप में, वितरित: सेट गेट के भीतर कोशिकाओं और कच्चे परख स्कोर का मतलब मूल्यों का प्रतिशत। प्रतिक्रियाओं सभी या एक अच्छी तरह से भीतर कोशिकाओं के बहुमत को प्रभावित जहां डेटा को देखने के बाद, अधिक सजातीय तरह से वैध है। ऊपर चर्चा के रूप में, इस तरह के मूल्यांकन प्रतिक्रिया आबादी के भीतर कोशिकाओं के एक सबसेट तक ही सीमित है, जहां अलग-अलग सेल डेटा gating के द्वारा afforded कि कम से कम उपयोगी है।
वर्णित कार्यप्रवाह की उपयोगिता siRNA या वर्णित मार्कर assays के द्वारा गड़बड़ी करने के लिए सीमित नहीं है। अध्ययन siRNA के संयोजन, रासायनिक inhibitors और विकिरण उपचार का उपयोग कर टिशू कल्चर प्रयोगों में और CDK6 के अलावा अन्य मार्करों और CDK2 गतिविधि 5 के आकलन के लिए प्रतिक्रियाओं परख के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है।
धारणा, प्रयोगात्मक रणनीति जैविक रूप से उपयोगी subcellular क्षेत्रों की एक किस्म के लिए स्वचालित रूप से पंजीकृत होने के लिए अनुमति देता हैफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप छवियों में मौजूद व्यक्ति की कोशिकाओं में। जैसे, इस दृष्टिकोण आबादी के बजाय व्यक्ति की कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित है कि तकनीक के माध्यम से याद किया जा सकता है कि मात्रात्मक, मल्टिप्लेक्स डेटा खुलासा जैविक जानकारी प्राप्ति कर सकते हैं। मामूली संशोधनों के साथ वर्णित दृष्टिकोण और विश्लेषण कार्यप्रवाह किसी भी प्रतिदीप्ति आधारित परख outputs और सेल जैविक प्रतिक्रियाओं के लिए मात्रात्मक, अलग-अलग सेल डेटा उपज कर सकते हैं जहां डीएनए सामग्री की मात्रात्मक आकलन, परमाणु या cytoplasmic प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव या इन दोनों के बीच मार्करों के चक्कर दो डिब्बों या तो व्यक्तिगत रूप से या एक मल्टिप्लेक्स ढंग से ब्याज की है। प्रकाशन की आवश्यकताओं को तेजी से इस तरह प्रकाशित डेटा reanalyze के लिए देख प्रयोगशालाओं के लिए भी प्रत्यक्ष ब्याज की हो जाएगा यहाँ वर्णित उन के रूप में खुले तौर पर सुलभ कच्चे आंकड़ों के उपयोग और माइक्रोस्कोपी छवि विश्लेषण के लिए नि: शुल्क उपकरण के साथ परिचय प्रस्तुत करने की दिशा में करते हैं।
वर्णित कार्यप्रवाह siRNA, बाद में मार्कर का पता लगाने का उपयोग कोशिकाओं की multiwell perturbance के लिए एक प्रक्रिया का गठन किया और अंत में जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों से मात्रात्मक डेटा की निकासी की सुविधा के लिए सॉफ्टवेयर-समर्थित कदम की एक श्रृंखला का उपयोग करें। दृष्टिकोण कई सेल आधारित अनुप्रयोगों में व्यापक व्यावहारिक आवेदन किया है जो व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए परमाणु और cytoplasmic तीव्रता मूल्यों के वितरण पर ध्यान केंद्रित कर रहा है। यहां इस्तेमाल उदाहरण डेटा G1 के चरण सेल चक्र पारगमन के लिए दो फ्लोरोसेंट assays के परीक्षण किया और वापस परमाणु डीएनए सामग्री का एक और अधिक प्रत्यक्ष biophysical उपाय करने के लिए सहसंबद्ध होते हैं जिसमें एक siRNA स्क्रीन स्थापित करने में उत्पन्न किया गया।
यह व्यक्ति की कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है और जिसके परिणामस्वरूप 'नाभिक मुखौटा' इसी cytoplasmi की पहचान करने के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में कार्य करता है के रूप में छवि परमाणु डीएनए के लिए एक फ्लोरोसेंट डीएनए दाग का उपयोग छवि विभाजन की प्रक्रिया में एक अनिवार्य कदम हैसी क्षेत्रों के। Stably कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जो GFP टैग CDK2 संवाददाता, अभी तक इस डिब्बे चित्रित किया जा सकता है जिसके द्वारा कोशिका द्रव्य में पृष्ठभूमि संकेत से लगातार उच्च एक चर देता है। एक ही विश्लेषण पाइपलाइन अन्य उपयुक्त प्रतिदीप्ति से जुड़े पत्रकारों और perturbance करने के लिए उनकी प्रतिक्रिया का उपयोग कर प्रोटीन स्थानान्तरण की घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जाना चाहिए। इसके अलावा, कोशिका द्रव्य-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंगों के साथ GFP-CDK2 संवाददाता प्रतिस्थापन इस एल्गोरिथ्म के वैकल्पिक उपयोग कोशिका द्रव्य के आयामों और छवियों में कोशिकाओं के सापेक्ष आकार को मापने के लिए अनुमति होगी।
यहाँ वर्णित छवि विभाजन की रणनीति में एक और डिजाइन को ध्यान डीएनए मात्रा का ठहराव के लिए एकीकृत तीव्रता मूल्यों देने के लिए सेल प्रोफाइलर का इस्तेमाल होता है। तीव्रता का एकीकरण धुंधला डेटा नाभिक आकार में संभव रूपांतरों के लिए अनुमति परमाणु डीएनए के लिए मूल्यों, और देखा मात्रा का ठहराव प्रोफाइल के लिए एक करीबी मैच का प्रतिनिधित्व करता हैके लिए propidium आयोडाइड दाग FACS के डेटा। हालांकि, एकीकृत तीव्रता प्रतिजन प्रतिदीप्ति का मतलब तीव्रता द्वारा उदाहरण औसत एकाग्रता, और अधिक जैविक रूप से एक सेल डिब्बे के भीतर प्रोटीन (और संबद्ध प्रतिदीप्ति) की एकीकृत कुल राशि से अधिक प्रासंगिक है, जहां प्रोटीन समारोह का आकलन करने के लिए एक उपयुक्त साधन प्रदान नहीं कर सकते। इसलिए तीव्रता मूल्यों पी-S780 RB1 और GFP डेटा के लिए इस्तेमाल किया गया है मतलब है। विकल्प सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर की 'ExportToSpreadsheet' पैनल पर पाया जाता है दो मोड (मतलब या एकीकृत) के आंकड़ों के मूल्यांकन के बीच परिवर्तन करने के लिए।
3_channels_pipeline.cppipe फ़ाइल में विश्लेषण सेटिंग्स उदाहरण डेटा सेट में छवियों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल के साथ नए छवियों सेट के विश्लेषण फ़ाइल नाम नामकरण परंपरा से ऊपर (चित्रा 3) में वर्णित अपनाने की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, संवेदनशीलता पृष्ठभूमि के लिए परमाणु डीएनए धुंधला और थ्रेसहोल्ड की चमक को सूट करने के मूल्योंनई छवि सेटों में तीव्रता सेल प्रोफाइलर सेटिंग्स के भीतर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। डीएनए धुंधला विभिन्न छवि विभाजन मास्क के निर्माण के लिए धारण महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए इस चैनल के लिए सही संवेदनशीलता सेटिंग्स के आवेदन सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर के साथ नई छवि डेटा के सफल विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। प्रदान की सेल प्रोफाइलर सेटिंग फ़ाइल (3_channels_pipeline.cppipe) नए आंकड़ों के विश्लेषण के अनुकूल ढालने के लिए सबसे अक्सर उपयोगी मानकों पर नोट्स हैं। इन नोटों सेल प्रोफाइलर मुख्य विंडो में स्क्रीन के शीर्ष पर टेक्स्ट बॉक्स में हैं और संवेदनशीलता सेटिंग्स बदल रहा है और चैनलों की संख्या का विश्लेषण किया जा करने के लिए समायोजन पर मार्गदर्शन शामिल हैं। नई छवि डेटा के लिए सेटिंग्स का परीक्षण करने के लिए प्रोटोकॉल खंड 2.8, में आरोपित के रूप में यह (चित्रा S1D '… पहचानें' वस्तुओं में से प्रत्येक के लिए 'नज़र' माउस को खुला क्लिक करके प्रोटोकॉल चरणों छवि विश्लेषण के दौरान छवि विभाजन का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक हो सकता है </strong>)। नाभिक मुखौटा सही ढंग से डीएनए धुंधला की छवियों से पहचाना जाता है विशेष रूप से, 'IdentifyPrimaryOjects' के माध्यम से छवि डेटा के दृश्य दिखाई देगा। 'IdentifyPrimaryOjects' मॉड्यूल के लिए सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर पृष्ठ पर दहलीज सुधार कारक है। इस मूल्य का परीक्षण और त्रुटि समायोजन सबसे परमाणु मान्यता त्रुटियों को ठीक कर देंगे। मूल्यों प्रत्येक छवि के लिए पृष्ठभूमि तीव्रता के खिलाफ डीएनए चैनल संतुलन। थ्रेसहोल्ड सुधार कारक मूल्यों इस से बड़ा और अधिक (स्पष्ट छवियों के लिए अच्छा है) कड़े और कम से कम एक उदार (धुंधला और पृष्ठभूमि के बीच कम विपरीत के साथ छवियों के लिए उपयुक्त) है, जहां एक, चारों ओर टिकी हुई हैं।
सेल प्रोफाइलर से अलग-अलग सेल डेटा के कच्चे उत्पादन अन्य अध्ययनों की आवश्यकताओं के अनुरूप करने के तरीके अलग में विश्लेषण किया जा सकता है। यहाँ दिखाया गया डेटा एक से जैविक प्रवृत्तियों निकालने की सहायता करने के क्रम में सेल प्रति मापा मापदंडों के दो फाटकों लागू करने के लिए एक पर्ल स्क्रिप्ट का इस्तेमाल होता हैअतिरिक्त माप के साथ की पहचान की उप-जनसंख्या के डी परमिट पार संदर्भित। यह सेल प्रोफाइलर के ढांचे के भीतर gating के तत्वों को शामिल करने के लिए समान रूप से संभव है, यहां इस्तेमाल वैकल्पिक मार्ग बड़े डेटा सेट का मूल्यांकन करने की आवश्यकता है विशेष रूप से करते हैं, तो अधिक से अधिक लचीलापन और गति प्रदान करता है। मौजूदा प्रोटोकॉल के बाद छवि अधिग्रहण चरणों में धीमी चरण सेल प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर के चल रहा है। अगर जरूरत सेल प्रोफाइलर यहाँ अलग गेट मूल्यों के साथ iteratively, और अधिक जल्दी बाद पर्ल स्क्रिप्ट के साथ reanalyzed किया जा सकता है जो एक संयुक्त राष्ट्र-गेटेड कच्चे डेटा सेट का निर्माण करने के फाटक लगाने के बिना चला जाता है। नहीं सभी अध्ययनों से इस रूप में उपयुक्त गेट मूल्यों संभावित समय के साथ डेटा के किसी भी सेट पर अभिकर्मकों के साथ बदलती हैं, और हो सकता है अग्रिम में पता चल जाएगा। यह इसलिए, उपयुक्त गेट valu की पहचान करने के क्रम में सकारात्मक नियंत्रण और नकली परेशान कोशिकाओं के लिए सेल प्रोफाइलर से प्राप्त कच्चे डेटा वितरण चित्रण histograms उत्पन्न करने के लिए सिफारिश की हैब्याज के मापदंडों के लिए तों।
पर्ल स्क्रिप्ट सेल प्रोफाइलर से डेटा की एक सख्ती से परिभाषित स्तंभ संरचना को स्वीकार करने के लिए लिखा जाता है और एक उपयोगकर्ता ExportToSpreadsheet 'सेटिंग्स का उपयोग सेल प्रोफाइलर द्वारा मापदंडों उत्पादन की संख्या को संशोधित अगर काम करना बंद कर सकते हैं। नोटों पर्ल स्क्रिप्ट फ़ाइलों के भीतर शामिल किए गए हैं सेटिंग्स के संशोधन को लागू करने में मदद करने के लिए। ये एक पाठ संपादक में स्क्रिप्ट दृश्य देखने के लिए, अधिमानतः एक प्रोग्रामर के पाठ संपादक (जैसे, http://www.activestate.com/komodo-edit) रंग कोड पर्ल तत्वों के लिए निर्धारित किया है। डेटा स्वरूप में बदलाव के लिए अनुकूल करने के लिए स्क्रिप्ट को समायोजित करने के लिए जहां ये नोट से संकेत मिलता है। पर्ल स्क्रिप्ट के लिए इसी प्रकार, छवि विश्लेषण डेटा से आंकड़ों की साजिश रचने के लिए निर्देश युक्त प्रदान की आर-कोड फ़ाइल (analysis.r), उपयोग और अनुकूलन पर अतिरिक्त नोटों को देखने के लिए एक पाठ संपादक या RStudio सॉफ्टवेयर में पढ़ा जा सकता है। इन नोटों को नियमित अभिव्यक्ति और पर्ल <पर विवरण के साथ पूरक किया जा सकता हैसमर्थन> 12 और डेटा, पढ़ा एनोटेट और क्रमश: साजिश रची है कैसे के लिए आधार के रूप में, जो दोनों के आर, के लिए ggplot2 13 पैकेज।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर नए अध्ययन के रूप में अच्छी तरह से खुला स्रोत प्रकाशनों के साथ जमा कच्चे डेटा ऐसे में यहाँ वर्णित उन के रूप में विश्लेषण के तरीकों के लिए उत्तरदायी हैं। उच्च सामग्री डेटा का स्वभाव किसी भी पर्यवेक्षक के अनुसंधान के हितों के आधार पर अलग विश्लेषणात्मक emphases साथ पुनरावर्ती विश्लेषण करने के लिए उधार देता है। डेटा के लिए कहा जा सकता है कि सवालों मूल रूप से प्रयोग किया जाता जांच द्वारा सीमित कर रहे हैं, छवि डेटा अक्सर सार्थक उन्हें उत्पन्न जो पढ़ाई के दायरे से परे reanalyzed जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम अनुदान CRUK 15,043 और CRUK 14,251 द्वारा समर्थित किया गया।
हम तकनीकी सहायता और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डैनियल Wetterskog और का केई हो धन्यवाद।
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AllStars negative control siRNA | Qiagen | 1027280 | Negative control siRNA. |
CDK6 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU |
RB1 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT |
5x siRNA buffer | Thermo Scientific | B-002000-UB-100 | To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water. |
Nulcease-free water (non-DEPC) | Applied Biosystems | AM9937 | For dilution of siRNA buffer. |
Hiperfect | Qiagen | 301705 | Transfection lipid. |
DMEM | Life Technologies | 41966052 | Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media. |
96 well tissue culture plate | Falcon | 3072 | Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes. |
Packard Viewplate | Perkin Elmer LAS | 6005182 | 96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates. |
Breathable membrane | Alpha Labs | LW2783 | Sterile, gas-permeable, adhesive membrane. |
Neutral buffered formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT5012-1CS | 10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100PC | Non-ionic detergent |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | For plate wash solution. |
Anti-P-S780 RB1 antibody | Abcam | ab32513 | Rabbit monoclonal |
AlexaFluor647 Anti-rabbit | Invitrogen | A21245 | Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody. |
Hoechst 33342 (Bisbenzimide) | Sigma-Aldrich | B2261 | Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye. |
Permeabilization solution | NA | NA | 0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0. |
Plate wash solution | NA | NA | Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20. |
Block solution | NA | NA | 5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies. |
Cell Profiler 2.1 | Broad Institute | http://www.cellprofiler.org/download.shtml | |
Active Perl Community Edition | ActiveState | http://www.activestate.com/activeperl/downloads | |
R programming environment | The R Foundation | http://www.r-project.org | |
Rstudio | Rstudio | http://www.rstudio.com/ |