蛍光標識された細胞の多重化された画像ベースの分析を可能に柔軟インフォマティクスワークフローがある発表。ワークフローは、核と細胞質のマーカーを定量化し、これらの区画の間のマーカー座を計算します。手順は、96ウェルフォーマットで、間接免疫蛍光法によってマーカーを検出するためのsiRNAで信頼性の高い方法論を用いた細胞の摂動のために提供される。
接着性の哺乳動物組織培養モデルにおける細胞の挙動を支配する制御機構を理解することにおける進歩は、単一細胞分析のモードにますます依存するようになってきている。細胞集団からのバイオマーカーの平均値を反映して、複合データを配信する方法は研究され、生物学的システムの不均一性を反映した亜集団のダイナミクスを失う危険性があります。これを踏まえて、従来の手法により置き換えられている、またはハイコンテント顕微鏡による評価を可能にするために開発された細胞アッセイの、より洗練された形でサポート。これらのアッセイは、潜在的にプロプライエタリソフトウェアパッケージに付属することで使用可能な蛍光バイオマーカーの大量の画像を生成、細胞あたりのマルチパラメトリック測定が可能になります。しかしながら、比較的高い資本コストと、これらのデバイスの多くのoverspecializationは多くの研究者に彼らのアクセス可能性を妨げてきた。
ここに記述されているほとんどの蛍光顕微鏡からの画像との使用に適した個々の細胞の特定の細胞内領域からの複数の蛍光標識強度の定量化のために普遍的に適用可能なワークフロー。このワークフローの鍵は、これらのイメージ内の個々の細胞を区別定義された細胞内領域に分割して、これらの領域に固有の蛍光マーカー強度値を提供するために自由に利用可能な細胞プロファイラソフトウェア1の実装です。画像データから個々のセルの強度値の抽出は、このワークフローの主な目的であり、接着性ヒト細胞におけるG1チェックポイントレギュレータのsiRNAスクリーニングからの制御データを解析して説明する。しかし、ここに提示ワークフローは、細胞摂動の他の手段からのデータの分析に適用することができる( 例えば 、化合物スクリーニング)このようにして、蛍光ベースの細胞マーカーの他の形態とは、研究室の広い範囲のために有用であるべきである。
ここで紹介する作品は、個々の細胞と定義された細胞内領域を同定する接着細胞の蛍光顕微鏡画像のアルゴリズム誘導内訳を実行するために自由に利用できるソフトウェアセルプロファイラの使用が記載されている。このアプローチは、画像セグメンテーションと呼ばれる(セグメント化オブジェクトと呼ぶ)は、各細胞または細胞内領域に局在蛍光標識マーカーを定量することによって画像化された細胞のその後のマルチパラメトリック分析が可能になる。このワークフローは、高含有量の分析を可能にするための基礎を構成し、さらに開発され、マルチパラメータに合わせて変更する、個々の細胞は特殊な高コンテンツ器具または独自のソフトウェアにアクセスすることなく、実験室で分析することができるツールとして役立つことを意図している。本稿に付属ファイルについて分析を生成するために、関連する原画像データ、アルゴリズム設定支持スクリプトのテストセットを含む。提供アルゴリズム設定fはまたは細胞プロファイラは、他の研究からの画像データの利用を可能にするために必要であるかもしれないものの調整例のデータセットとディスカッションセクションの詳細のために最適化される。
定量的データは、Cellプロファイラを使用して抽出された後、別の研究室は、生データ内の個々のセルの値によって提示された情報を使用する方法のための異なる要件を有していてもよい。ここに示されているゲートは、各アッセイのために生データに適用されることにより、一つのアプローチである。これらのゲートを使用して、データがゲートによって定義された応答を受けた細胞の亜集団と異なる処理を結ぶ傾向の可視化を可能にする、応答のバイナリ条件に変換される。ゲートは、それぞれの関連測定のための適切な陰性および陽性対照について得られたデータ分布の観察に基づいて設定されている。ゲートの使用は、生、細胞ベースの測定を管理する方法のほんの一例である。また、ここに示した核DNA強度の使用である私にゲートされたデータと組み合わせて、連続した範囲の値としての生の形でasurements。画像解析データを管理するための他のアプローチは、調査の性質に応じて、考慮されるべきである。部分集団に細胞を割り当てるためのゲートを用いて統計的選択肢が2報告されており、パラメータの多数にわたって高いコンテンツデータを要約するための戦略の系統的比較は3に報告されている。
6 –画像データの高含有量分析は、薬物応答の細胞研究における用途が見出されている、遺伝学および4シグナリング環境ストレスを逆転。高含有量の分析の利点は、蛍光顕微鏡データのアルゴリズム的解析は、定量的および空間的なパラメータは、個々のセル7で同時に考慮されることを可能にするという事実から生じる。このように、複数のアッセイのための細胞の結果は、アッセイdの相互参照、差動動作することができefined細胞亜集団は、形態学的な変数を考慮を含むことができ、実験条件およびアッセイ内で追跡することができる。戦略、ここで説明する解析ワークフローは、他の高含量のアプローチのように、個々のセルへの相互参照された多重化データを配信することが可能である。蛍光顕微鏡画像を生成する画像の数千までの低スループットは従来の蛍光ベースの顕微鏡検査で生成された画像の数の範囲のデータの分析に適用可能な高含量の方法スーツ研究自動化ハイコンテンツスクリーニングプラットフォームを用いて製造。
ワークフローは、別のアッセイは、核蛍光マーカー強度またはそれぞれの蛍光レポータータンパク質の細胞質/核移行、のいずれかの点で測定されるデータ例をここに図示されている。これらのアッセイは、EACに応じて、別々にまたは組み合わせて考慮することができるという点で、ワークフローが柔軟であるhは異なる研究者によって研究課題を与えられた。例えばデータは、RNA干渉(RNAi)実験( 図1)の一部として製造される。低分子干渉RNAオリゴヌクレオチド(siRNA)は、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)の活性の二つの蛍光レポーターのための変化をもたらすHCT116ヒト結腸直腸癌細胞中の特定のタンパク質をノックダウンするために使用される。セリン780(P-S780のRB1)における核網膜芽細胞腫タンパク質のCDK6依存性リン酸化は、抗体染色によって評価される。同じ細胞では、CDK2活性(GFP-CDK2レポーター)の緑色蛍光タンパク質タグ付きレポーターはCDK2活性の非存在下でレポーターは細胞質に核及びCDK2活性シャトル上に存在する細胞質比にその核によって評価される8。加えて、各細胞の核DNAは細胞を同定し、同様に画像内の核の境界線を定義するための手段として機能するDNAインターカレート色素、ビスベンズイミドを用いて染色されDNAの存在量のsaの尺度は、( 図2)細胞の細胞周期位置に関する情報を提供する。
CDK6およびCDK2の活性は、細胞周期5のG1からS期への細胞の通過として検出可能であるような、個々の細胞内の2つのレポーターの間の緊密な一致が予想されるように、互いに9,10成功し。ここで使用されるデモデータセットを例として分析siRNAの効果は、CDK6、網膜芽細胞腫タンパク質(RB1)及び非標的化ネガティブコントロール( 表1)を標的とする。 CDK6のノックダウンは、P-S780のRB1エピトープの減少および細胞周期のG1期における細胞の蓄積の両方を引き出すべきである。 RB1のノックダウンは、リン酸化S780抗体の特異性のための試薬対照として役立つ。ホルマリン固定された11からの蛍光顕微鏡画像は、蛍光染色されたHCT116組織培養細胞は、アルゴリズムの画像解析のために使用される。得られた数値データは、その後に使用されるクロスリファレンス記者や、異なるノックダウン状態の影響を評価。
このタイプの分析によって生成されたデータの潜在的な大きさは通常の解析ツールへの課題を提示することができます。例えば、個々のセルデータは、いくつかの表計算ソフトを収容するよりも大きくすることができる。大きなデータセットの分析を支援するためのデータの単純な、高度に反復的な、教師の処理を行うのPerlスクリプトが含まれる。 Perlスクリプトは、特定のファイルの命名規則( 図3)で画像ファイルを処理する際に細胞プロファイラ、によって生成される出力ファイルのために特別に書かれた、と分析に使用するウェル当たりのフィールド変数番号を可能にしている。これは、細胞亜集団5の動向を追跡するためにゲート個々の細胞アッセイデータに頻繁に重要であり、ここに示されている各アッセイタイプについて、所定の設定ゲートに基づいて、各セルは、フラグにPerlスクリプトを使用することである。また、オプションのPerlスクリプトも含まれていますその実現、個々のウェル(または条件)のためのデータの結果を要約:セットのゲート内の細胞の割合と生の検定スコアの平均値を。応答はすべて、またはウェル内の細胞の大部分に影響を与える場所データを表示するの後者の、より均質な方法は、有効である。上述のように、そのような評価は、応答が、集団内の細胞のサブセットに限定される個々のセルデータゲーティングによってもたらされるものよりもあまり有用である。
記載されたワークフローの有用性は、siRNA又は説明マーカーアッセイによって摂動に限定されるものではない。研究は、siRNAの組み合わせ、化学阻害剤および放射線治療を用いて組織培養実験およびCDK6以外のマーカーの評価及びCDK2活性5に対する応答をアッセイするためにこのアプローチを使用している。
概念的には、実験的な戦略は、生物学的に有用な細胞内領域が多様に自動的に登録されることを可能にする蛍光顕微鏡画像中に存在する個々の細胞である。このように、このアプローチは、集団ではなく、個々のセルに焦点技術によって見逃され得る生物学的情報を明らかにし、定量的、多重化されたデータを得ることができる。軽微な変更で、説明されたアプローチおよび分析ワークフローは、任意の蛍光ベースのアッセイ出力および細胞生物学的応答、DNA含有量の定量的評価、核または細胞質の蛍光またはこれらの間のマーカーの往復の定量のための定量的な、個々のセルのデータを得ることができる二つの区画個別にまたは多重化方式では重要である。パブリッシングの要件はますます公然とアクセス可能な生データの提出に向けて傾向があるように、このようなここに記載されているような顕微鏡画像解析のためにアクセスし、無料ツールに精通も公開されたデータを再分析するために探してラボへの直接対象としています。
記載されたワークフローは、siRNA、その後のマーカー検出を用いた細胞のウェル摂動する手順を構成し、最終的に得られた蛍光顕微鏡画像から定量的データの抽出を容易にするために、ソフトウェアでサポートされている一連のステップの使用。アプローチは、多くの細胞ベースのアプリケーションにおいて幅広い実用的用途を有する個々の細胞の核および細胞質強度値の送達に焦点を当てている。ここで使用される例示的なデータは、G1期の細胞周期の通過のための2つの蛍光アッセイは、試験され、バック核DNA含有量のより直接的な生物物理学的測定値に相関されたsiRNAの画面の設定で生成された。
それは個々の細胞の同定を可能にし、得られた「核マスクが「対応cytoplasmiを識別するための出発点として機能するように、画像の核DNAに蛍光DNA染色の使用は、画像分割プロセスに不可欠なステップであるC領域。安定的に細胞内で発現されたGFPタグCDK2の記者は、まだこのコンパートメントは描写することが可能な細胞質中のバックグラウンドシグナルよりも一貫して高い変数を提供します。同じ分析パイプラインは、他の適当な蛍光連結記者や摂動に対する応答を使用してタンパク質転位事象の分析に適用可能であるべきである。また、細胞質特異的蛍光色素を用いてGFP-CDK2レポーターを代入すると、このアルゴリズムの代替的な使用は、細胞質の次元画像中の細胞の相対的な大きさを測定することを可能にする。
ここで説明する画像分割戦略の別の設計考慮事項は、DNAの定量化のための統合された強度値を提供するセルプロファイラを使用することである。核DNAの染色データに対する強度値の積分核のサイズの可能なバリエーションを可能と見られる定量化プロファイルの近い一致を表すヨウ化プロピジウムのためのFACSデータを染色した。しかし、積分強度は、抗原の蛍光の平均強度によって例示平均濃度は、細胞コンパートメント内でより生物学的に関連するタンパク質の集積総量(および関連蛍光)よりもタンパク質の機能を評価するための適切な手段を提供することができない。したがって、強度値は、P-S780 RB1及びGFPのデータのために使用したことを意味する。データ評価の2つのモードを変更するオプションが(平均または統合)細胞プロファイラソフトウェアの「ExportToSpreadsheet」パネルに記載されています。
3_channels_pipeline.cppipeファイル内の解析設定は、例えば、データセット内の画像のために最適化される。このプロトコルを使用して新しいイメージのセットの分析は、ファイル名が命名規則は、上記( 図3)に記載採用することを必要とします。また、感度は、バックグラウンド核DNA染色としきい値の明るさに応じた値新しい画像セットにおける強度は、Cellプロファイラの設定内で調整する必要があるかもしれない。 DNA染色は、様々な画像セグメンテーションマスクを作成するための保持に重要な役割を考えると、このチャネルの正しい感度設定の適用は、細胞プロファイラソフトウェアと新たな画像データの解析に成功の鍵である。提供される細胞プロファイラ設定ファイル(3_channels_pipeline.cppipe)は、新しいデータに分析を適合させるための最も頻繁に有用なパラメータに関する注意事項が含まれています。これらのノートは、Cellプロファイラーのメインウィンドウで、画面上部のテキストボックスにあり、感度の設定を変更し、分析するチャネル数を調整する上でのガイダンスが含まれています。新たな画像データの設定をテストするために、プロトコルのセクション2.8で起訴されたように、プロトコルステップ'…オブジェクトを識別する」をそれぞれについて「目」のアイコンを開く]をクリックして画像解析時の画像分割を観察する必要があるかもしれない( 図S1D </strong>)。核マスクが正しくDNA染色の画像から特定された場合、特に、「IdentifyPrimaryOjects 'を介して画像データの視覚化は、表示される。 「IdentifyPrimaryOjects」モジュールのセル·プロファイラソフトウェアページで閾値補正係数である。この値の試行錯誤調整はほとんどの核認識エラーを修正します。値は、各画像のバックグラウンド強度に対するDNAのチャネルのバランスをとる。閾値補正係数値の周りの1、これよりも大きいが、より厳しい(クリアな画像のために良い)で、1未満(染色と背景の少ないコントラストの画像に適した)寛大ですヒンジ。
細胞プロファイラからの個々のセルデータの生の出力は、他の研究者のニーズに合わせて様々な方法で分析することができる。ここに示したデータanから生物学的な傾向を抽出することを支援するために、セルごとに測定されたパラメータのうちの2つにゲートを適用するためのPerlスクリプトの使用である追加の測定で識別部分集団のD許可相互参照。それは、Cellプロファイラの枠組みの中でゲーの要素を含むことも同様に可能ではあるが、ここで使用される代替ルートは、大規模なデータセットを評価する必要がある場合には特に、より高い柔軟性とスピードを提供します。現在のプロトコルの後の画像取得の段階で最も遅い段階は、Cellプロファイラソフトウェアの実行されています。ここで細胞プロファイラは、必要に応じて反復的に異なるゲート値で、より迅速に、その後のPerlスクリプトを再分析することができ、未ゲーテッド生データセットを生成するためにゲートをかけることなく実行されます。すべての研究は、このように適切なゲート値はデータの任意のセットで、潜在的に時間をかけての試薬と異なる場合があり、事前に知っているわけではありません。したがって、適切なゲートバリューを識別するために、陽性対照およびモデル摂動細胞について細胞プロファイラから得られた生データ配信を示すヒストグラムを生成することをお勧めです興味のあるパラメータのためのES。
Perlスクリプトは、Cellプロファイラからのデータの厳密に定義された列構造を受け入れるために、ユーザーが「ExportToSpreadsheet」設定を用いて細胞プロファイラによってパラメータ出力の数を変更する場合は、作業を停止することが書かれています。ノートはPerlのスクリプトファイル内に含まれる設定の変更を実装するのに役立ちます。これらはテキストエディタでスクリプトを表示する表示するには、好ましくは、プログラマのテキストエディタ( 例えば 、http://www.activestate.com/komodo-edit)カラーコードPerlの要素に設定されています。これらのノートは、データフォーマットの変化に適応するためのスクリプトを調整する場所を示す。 Perlスクリプト、(analysis.r)提供R-コードファイルと同様に、画像解析データから数値をプロットするための命令を含む、使用および適応に追加したメモを参照し、テキストエディタやRStudioソフトウェアで読み取ることができます。これらのノートは、正規表現とPerlについての詳細を補足することができる<> 12(商標)、それぞれ、データは、読み込みアノテートしてプロットされている方法の基礎を形成し、どちらもR用ggplot2 13パッケージ。
蛍光顕微鏡を用いて新たな研究と同様のオープンソースの出版物に寄託生データは、ここに記載されるような分析方法に適している。高コンテンツデータの本質は、任意の観察者の研究関心に応じて、異なる分析的な強調を持つ再帰的な分析に適しています。データの求められることができる質問はもともと使用されるプローブによって制限されていますが、画像データは、多くの場合、意味のある、それを生成した研究の範囲を超えて再分析することができます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、助成金CRUK 15043とCRUK 14251によってサポートされていました。
私たちは、技術支援や原稿の重要な読書のためのダニエルWetterskogおよびKa圭ホーに感謝。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AllStars negative control siRNA | Qiagen | 1027280 | Negative control siRNA. |
CDK6 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU |
RB1 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT |
5x siRNA buffer | Thermo Scientific | B-002000-UB-100 | To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water. |
Nulcease-free water (non-DEPC) | Applied Biosystems | AM9937 | For dilution of siRNA buffer. |
Hiperfect | Qiagen | 301705 | Transfection lipid. |
DMEM | Life Technologies | 41966052 | Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media. |
96 well tissue culture plate | Falcon | 3072 | Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes. |
Packard Viewplate | Perkin Elmer LAS | 6005182 | 96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates. |
Breathable membrane | Alpha Labs | LW2783 | Sterile, gas-permeable, adhesive membrane. |
Neutral buffered formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT5012-1CS | 10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100PC | Non-ionic detergent |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | For plate wash solution. |
Anti-P-S780 RB1 antibody | Abcam | ab32513 | Rabbit monoclonal |
AlexaFluor647 Anti-rabbit | Invitrogen | A21245 | Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody. |
Hoechst 33342 (Bisbenzimide) | Sigma-Aldrich | B2261 | Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye. |
Permeabilization solution | NA | NA | 0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0. |
Plate wash solution | NA | NA | Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20. |
Block solution | NA | NA | 5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies. |
Cell Profiler 2.1 | Broad Institute | http://www.cellprofiler.org/download.shtml | |
Active Perl Community Edition | ActiveState | http://www.activestate.com/activeperl/downloads | |
R programming environment | The R Foundation | http://www.r-project.org | |
Rstudio | Rstudio | http://www.rstudio.com/ |