Presentato è un flusso di lavoro flessibile, l'informatica che consente l'analisi di immagini basata multiplex di cellule fluorescente. Il flusso di lavoro quantifica marcatori nucleari e citoplasmatici e calcola marcatore traslocazione tra questi compartimenti. Le procedure sono previste per la perturbazione di cellule utilizzando siRNA e metodologia affidabile per il rilevamento marcatore mediante immunofluorescenza indiretta in formati da 96 pozzetti.
I progressi nella comprensione dei meccanismi di controllo che disciplinano il comportamento delle cellule in coltura di tessuti aderenti modelli mammiferi stanno diventando sempre più dipendenti dalle modalità di analisi singola cellula. Metodi che forniscono i dati compositi che riflettono i valori medi dei biomarcatori di popolazioni cellulari rischiano di perdere dinamiche sottopopolazione che riflettono l'eterogeneità del sistema biologico studiato. In linea con questo, gli approcci tradizionali vengono sostituiti da, o supportati con forme più sofisticate di test cellulari sviluppati per consentire la valutazione al microscopio ad alto contenuto. Questi test potenzialmente generare un gran numero di immagini di biomarcatori fluorescenti, che hanno permesso accompagnando pacchetti di software proprietario, consente per le misure multi-parametriche per cella. Tuttavia, i costi relativamente elevati di capitale e superspecializzazione di molti di questi dispositivi hanno impedito la loro accessibilità a molti ricercatori.
Descritto qui è unworkflow universalmente applicabili per la quantificazione di più intensità marcatori fluorescenti da specifiche regioni subcellulare di cellule singole adatti per l'uso con le immagini dalla maggior parte microscopi a fluorescenza. La chiave di questo flusso di lavoro è l'implementazione del software Profiler cellulare liberamente disponibile da 1 a distinguere le cellule individuali in queste immagini, li segmento in regioni subcellulari definite e fornire intensità marcatore di fluorescenza valori specifici di queste regioni. L'estrazione dei singoli valori di intensità di cellule dai dati immagine è lo scopo centrale di questo flusso di lavoro e verrà illustrato con l'analisi dei dati di controllo da una schermata di siRNA per G1 regolatori checkpoint in cellule umane aderenti. Tuttavia, il flusso di lavoro qui presentata può essere applicato all'analisi dei dati da altri mezzi perturbatori cellulare (per esempio, schermi composti) e altre forme di marcatori cellulari fluorescenza base e quindi dovrebbe essere utile per una vasta gamma di laboratori.
Il lavoro qui presentato descrive l'uso del software Profiler cella liberamente disponibili per eseguire ripartizione algoritmo guidata di immagini di microscopia a fluorescenza di cellule aderenti per identificare le singole cellule e regioni subcellulari definite. Questo approccio, denominato segmentazione di immagini, consente la successiva analisi multi-parametrica delle cellule immaginati quantificando marcatori fluorescente localizzate ad ogni cella o regione subcellulare (denominato oggetti segmentate). Questo flusso di lavoro costituisce la base per consentire l'analisi ad alta contenuto e lo scopo di servire come uno strumento che può essere ulteriormente sviluppato e modificato per soddisfare multi-parametrica, analisi singola cellula in laboratorio senza accesso agli strumenti ad alto contenuto specializzati o software proprietario. I file forniti con questo manoscritto includono una serie di test di importanti dati di immagine grezzi, le impostazioni di algoritmo e script di supporto per generare l'analisi descritto. La condizione impostazioni algoritmo fo Profiler cellulare sono ottimizzati per i set di dati di esempio ei dettagli sezione Discussioni quanto possono essere necessari aggiustamenti per consentire l'uso dei dati di immagine provenienti da altri studi.
Una volta dati quantitativi è stato estratto utilizzando Profiler cellulare, laboratori diversi possono avere esigenze diverse per come utilizzare le informazioni presentate dai valori delle celle individuali nei dati grezzi; mostrato qui è un approccio con cui porte vengono applicati ai dati grezzi per ogni test. Usando questi cancelli, i dati sono trasformati in termini binarie di risposta, consentendo la visualizzazione delle tendenze collegano diversi trattamenti con le sottopopolazioni di cellule in risposta definito dalle porte. Le porte sono impostati sulla base di osservazioni delle distribuzioni di dati ottenuti appropriati controlli negativi e positivi per ogni misura rilevante. L'uso dei cancelli è solo un esempio di come gestire le misure, basati su celle prime. Anche qui mostrato è l'uso di intensità DNA nucleare measurements nella loro forma grezza come un intervallo continuo di valori in combinazione con i dati gated. Altri approcci per la gestione dei dati di analisi di immagine devono essere considerati, a seconda della natura dello studio; alternative statistici all'utilizzo cancelli per l'assegnazione di celle a sottopopolazioni sono stati segnalati 2 e sistematiche confronto tra le strategie per riassumere i dati ad alta contenuto attraverso un gran numero di parametri sono stati segnalati 3.
Analisi-alto contenuto di dati immagine hanno trovato impiego in studi cellulari di droga-risposta, invertire la genetica e stress ambientale segnalazione 4-6. Il merito di analisi ad alto contenuto di deriva dal fatto che l'analisi algoritmica dei dati microscopia a fluorescenza permette parametri quantitativi e spaziali da considerare simultaneamente in singole celle 7. In questo modo, esiti cellulari per analisi multiple possono essere, comportamento differenziale incrociato dei test-dsottopopolazioni cellulari efined possono essere monitorati all'interno di condizioni sperimentali e test possono includere la considerazione di variabili morfologiche. Il flusso di lavoro strategie e analisi discusso qui, come per altri approcci ad alto contenuto, sono in grado di fornire dati multiplex che sono riferimenti incrociati alle singole celle. Studi ad alto contenuto di metodi tuta che generano immagini al microscopio a fluorescenza e sono applicabili all'analisi dei dati che vanno da decine di immagini prodotte in basso erogato microscopia convenzionale basato sulla fluorescenza attraverso le migliaia di immagini prodotte utilizzando piattaforme ad alto contenuto di screening automatizzati.
Il flusso di lavoro è illustrata qui con i dati di esempio da cui test separati sono misurate in termini di intensità sia marcatori fluorescenti nucleari o traslocazione citoplasmatica / nucleare di una proteina reporter fluorescente, rispettivamente. Il flusso di lavoro è flessibile in quanto questi saggi possono essere considerati separatamente o in combinazione seconda each dato domanda di ricerca da diversi ricercatori. I dati di esempio sono prodotti come parte di una interferenza dell'RNA (RNAi) esperimento (Figura 1). Piccoli oligonucleotidi RNA interferenti (siRNA) vengono utilizzati per atterramento specifiche proteine in cellule di carcinoma colorettale umano HCT116 che danno luogo a cambiamenti per due reporter fluorescenti di chinasi (CDK) attività di ciclina-dipendente. La fosforilazione CDK6-dipendente della proteina retinoblastoma nucleare di serina 780 (P-S780 RB1) è valutata con anticorpi colorazione. Nelle stesse cellule, una proteina fluorescente-tag giornalista verde di attività CDK2 (GFP-CDK2 giornalista) è valutata dal nucleare rapporto citoplasmatica dove in assenza di attività CDK2 reporter risiede nel nucleo e su navette attivazione CDK2 nel citoplasma 8. Inoltre, il DNA nucleare di ciascuna cella viene tinto con un colorante-DNA intercalanti, Bisbenzimide, che serve come mezzo per identificare le cellule e definire i confini nuclei nelle immagini così unmisura sa dell'abbondanza DNA fornire informazioni sulla posizione del ciclo di cella della cella (Figura 2).
Le attività di CDK2 e CDK6 sono rilevabili come cellule transito da G1 alla fase S del ciclo cellulare 5 e succedono 9,10 e, come tale, stretta concordanza tra i due reporter in cellule singole è previsto. L'insieme di dati di dimostrazione qui utilizzato analizza come esempio l'effetto di siRNA obiettivi CDK6, proteina retinoblastoma (RB1) e un controllo negativo non-targeting (Tabella 1). Knockdown di CDK6 deve provocare sia una diminuzione della RB1 epitopo P-S780 e un accumulo di cellule in fase G1 del ciclo cellulare. Il knockdown RB1 serve da controllo reattivo per la specificità dell'anticorpo fosfo-S780. Immagini al microscopio a fluorescenza da formalina fisso 11, colture cellulari HCT116 fluorescenti colorate vengono utilizzati per l'analisi delle immagini algoritmica. I dati numerici risultante viene quindi utilizzato perriferimento incrociato i giornalisti e misurare l'impatto dei diversi stati atterramento.
La dimensione potenziale dei dati prodotti da questo tipo di analisi può presentare una sfida per normali strumenti di analisi. Ad esempio, i dati delle celle individuali possono essere più grandi di alcuni software foglio ospiterà. Incluso sono script Perl che eseguono semplici, altamente ripetitivo, lavorazione sotto la supervisione dei dati per aiutare l'analisi di grandi set di dati. Gli script Perl sono scritti appositamente per i file di output prodotti da cellule Profiler, durante l'elaborazione di file di immagini con una specifica convenzione di denominazione dei file (Figura 3), e consentono un numero variabile di campi per bene da utilizzare nell'analisi. Spesso è importante dati del saggio cancello singola cella per monitorare tendenze sottopopolazioni di cellule 5 e qui illustrato è l'uso di uno script Perl per contrassegnare ogni cella basata su un cancello insieme predeterminato per ogni tipo di saggio. Sono inclusi anche gli script opzionali Perlche riassumono l'esito dei dati per i singoli pozzi (o condizioni), offrendo: percentuale di cellule all'interno del cancello set ed i valori medi dei punteggi del test grezzi. Quest'ultimo modo più omogenea visualizzazione dati, vale dove risposte influenzano tutti o la maggior parte delle cellule all'interno di un pozzo. Come discusso sopra, tale valutazione è meno utile di quello previsto dalla persona gating dati cella in cui la risposta si limita a un sottogruppo di cellule all'interno di una popolazione.
L'utilità del flusso di lavoro descritto non è limitato alle perturbazioni da siRNA o saggi marcatori descritti. Gli studi hanno utilizzato questo approccio per saggiare le risposte in tessuto esperimenti di coltura utilizzando combinazioni di siRNA, inibitori chimici e trattamento con radiazioni e per la valutazione dei marcatori diversi CDK6 e l'attività CDK2 5.
Concettualmente, la strategia sperimentale permette una varietà di regioni subcellulari biologicamente utili da registrare automaticamentein singole cellule presenti nelle immagini al microscopio a fluorescenza. Come tale, questo approccio può produrre, dati multiplex rivelare informazioni biologiche quantitative che possono perdere attraverso tecniche che si concentrano sulle popolazioni piuttosto che singole celle. Con piccole modifiche, il flusso di lavoro di avvicinamento e di analisi descritto può produrre, i dati delle singole celle quantitativi per le uscite di analisi basate sulla fluorescenza e le risposte delle cellule-biologica, in cui la valutazione quantitativa del contenuto di DNA, la quantificazione della fluorescenza nucleare o citoplasmatica o la spola di marcatori tra queste due scomparti singolarmente o in modo multiplex è di interesse. Come requisiti editrici tendono sempre più verso la presentazione dei dati grezzi apertamente accessibili, l'accesso e la familiarità con strumenti gratuiti per l'analisi di immagini di microscopia, come quelle descritte qui sarà anche di diretto interesse per i laboratori in cerca di rianalizzare i dati pubblicati.
Il flusso di lavoro descritto costituisce una procedura di perturbazione multipozzetto di cellule utilizzando siRNA, successiva rivelazione marcatore e infine uso di una serie di procedure del software supportato per facilitare l'estrazione dei dati quantitativi risultanti dalle immagini al microscopio a fluorescenza. L'approccio è focalizzato sulla consegna di valori di intensità nucleari e citoplasmatici per singole celle, che ha ampia applicazione pratica in molte applicazioni basati su celle. I dati di esempio utilizzati qui è stato generato in un ambiente schermo siRNA in cui due saggi fluorescenti per il transito ciclo cellulare fase G1 sono testati e correlati tornare a una misura più diretta biofisica del contenuto di DNA nucleare.
L'uso di un colorante fluorescente per DNA immagine DNA nucleare è un passo indispensabile nel processo di segmentazione dell'immagine in quanto consente l'identificazione delle singole cellule e la conseguente 'maschera Nuclei' serve come punto di partenza per identificare corrispondente cytoplasmiregioni c. Il CDK2 giornalista GFP-tag, che è stabilmente espressa nelle cellule, dà una variabile ancora costantemente superiore segnale di fondo nel citoplasma con cui questo vano può essere delineata. La stessa analisi condotta dovrebbe essere applicabile all'analisi degli eventi proteine traslocazione con altri reporter fluorescenza legati adatti e la loro risposta alla perturbazione. Inoltre, sostituendo il reporter GFP-CDK2 con coloranti fluorescenti specifici citoplasma consentirebbe l'uso alternativo di questo algoritmo per misurare le dimensioni del citoplasma e le dimensioni relative delle cellule nelle immagini.
Un'altra considerazione di progetto nella strategia di segmentazione dell'immagine qui descritto è l'uso di Profiler cellulare per fornire valori di intensità integrati per la quantificazione del DNA. Integrazione dell'intensità valori per il DNA nucleare dati colorazione permettono di possibili variazioni nelle dimensioni nucleo, e rappresenta un fiammifero vicino per i profili di quantificazione vistoper propidio ioduro macchiato FACS dati. Tuttavia, l'intensità integrata non può fornire uno strumento adeguato per valutare la funzione della proteina dove la concentrazione media, esemplificato da intensità media di antigene di fluorescenza, è biologicamente più rilevante rispetto alla quantità totale integrata di proteine (e fluorescenza associata) all'interno di un compartimento cellulare. Quindi significa valori di intensità sono stati utilizzati per la P-S780 RB1 e dati GFP. L'opzione per alterare tra le due modalità (media o integrato) di valutazione dei dati si trova sul pannello 'ExportToSpreadsheet' del software Profiler cella.
Le impostazioni di analisi nel file 3_channels_pipeline.cppipe sono ottimizzati per le immagini del set di dati di esempio. Analisi di nuove immagini set con questo protocollo sarà necessario che i nomi dei file adottano la convenzione di denominazione sopra descritto (Figura 3). Inoltre, la sensibilità valori in base alla luminosità della colorazione del DNA nucleare e le soglie per lo sfondointensità dei nuovi set di immagini potrebbe essere necessario regolare all'interno delle impostazioni Profiler cellulare. Dato il ruolo chiave della colorazione DNA contiene per costruire le varie maschere di segmentazione dell'immagine, l'applicazione di impostazioni di sensibilità corrette per questo canale è essenziale all'analisi successo di nuovi dati di immagine con il software Profiler cellulare. Il file di impostazioni Profiler cellulare fornito (3_channels_pipeline.cppipe) contiene note su dei parametri più utili per adattare l'analisi di nuovi dati. Queste note sono nella casella di testo nella parte superiore dello schermo nella finestra principale Profiler cellulare e includono una guida su come modificare le impostazioni di sensibilità e regolazione del numero di canali da analizzare. Come incriminato nella sezione protocollo 2.8, per testare le impostazioni per i nuovi dati di immagine può essere necessario per osservare la segmentazione delle immagini durante l'analisi delle immagini cliccando aprire le icone 'occhio' per ciascuno dei 'Identificare … Objects fasi di protocollo (Figura S1D </strong>). In particolare, la visualizzazione dei dati di immagine attraverso 'IdentifyPrimaryOjects' mostrerà se la maschera Nuclei è identificato correttamente dalle immagini della colorazione DNA. Nella pagina software Profiler cellulare per il modulo "IdentifyPrimaryOjects 'è il fattore di correzione soglia. Tentativi ed errori regolazione di questo valore sarà risolvere la maggior parte degli errori di riconoscimento nucleari. I valori di equilibrio del canale DNA contro l'intensità di sfondo per ogni immagine. Valori del fattore di correzione Soglia cerniera circa 1, dove più grande di questo è più spinto (buono per le immagini chiare) e meno di 1 è indulgente (adatti per le immagini con meno contrasto tra la colorazione e lo sfondo).
L'uscita dei dati grezzi singola cella da Profiler cellulare può essere analizzata in vari modi per soddisfare le esigenze di altri studi. Qui è illustrato l'uso di uno script Perl per applicare porte a due dei parametri misurati per cella al fine di assistere l'estrazione tendenze biologiche dalla un datod permesso incrociato delle sottopopolazioni individuate con ulteriori misurazioni. Anche se è ugualmente possibile includere elementi di gating nell'ambito della Profiler Cell, il percorso alternativo usato qui fornisce una maggiore flessibilità e velocità, in particolare se grandi insiemi di dati devono essere valutate. La fase più lenta nelle fasi di acquisizione post-immagine del protocollo attuale è la gestione del software Profiler cella. Profiler cellulare qui viene eseguito senza imporre porte per produrre un insieme di dati grezzi non-gated che può essere rianalizzato con conseguente script Perl più rapidamente e, se necessario, iterativamente con diversi valori di gate. Non tutti gli studi conoscere in anticipo i valori di gate adatti come questo può variare con reagenti in un dato insieme di dati, e potenzialmente nel tempo. E ', quindi, consigliabile per generare istogrammi raffiguranti la distribuzione dei dati grezzi ottenuti da Profiler cellulare per i controlli positivi e le cellule mock-perturbate al fine di individuare idonei valu cancelloes per i parametri di interesse.
Sono scritti Gli script Perl ad accettare una struttura della colonna rigidamente definito di dati da Profiler cellulare e può smettere di funzionare se un utente modifica il numero di uscita parametri Profiler cellulare utilizzando le impostazioni della 'ExportToSpreadsheet'. Per contribuire ad attuare la modifica delle impostazioni note sono inclusi all'interno dei file di script Perl. Per vedere questi visualizzare lo script in un editor di testo, preferibilmente editor di testo per programmatori impostata codice colore elementi Perl (ad esempio, http://www.activestate.com/komodo-edit). Queste note indicano dove per regolare lo script di adattarsi ai cambiamenti nel formato dei dati. Simile agli script Perl, il file R-codice fornito (analysis.r), che contiene le istruzioni per tracciare i dati dai dati di analisi di immagine, può essere letto in un editor di testo o software rstudio vedere note aggiuntive sull'uso e l'adattamento. Queste note possono essere completato con i dettagli sulle espressioni regolari e Perl <sup> 12 e il pacchetto ggplot2 13 per R, entrambi i quali formano la base per come i dati vengono letti, annotato e tracciati rispettivamente.
Nuovi studi usando la microscopia a fluorescenza, nonché dati grezzi depositati con le pubblicazioni open source sono suscettibili di metodi di analisi, come quelle qui descritte. La natura stessa dei dati ad alta contenuto si presta ad analisi ricorsiva con accentuazioni diverse analitiche a seconda degli interessi di ricerca di ogni osservatore. Anche se le domande che possono essere poste dei dati sono limitati dalle sonde utilizzate originariamente, i dati delle immagini possono essere spesso significato rianalizzati oltre l'ambito degli studi che le hanno generate.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni CRUK 15043 e 14251 CRUK.
Ringraziamo Daniel Wetterskog e Ka Ho Kei per l'assistenza tecnica e la lettura critica del manoscritto.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AllStars negative control siRNA | Qiagen | 1027280 | Negative control siRNA. |
CDK6 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU |
RB1 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT |
5x siRNA buffer | Thermo Scientific | B-002000-UB-100 | To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water. |
Nulcease-free water (non-DEPC) | Applied Biosystems | AM9937 | For dilution of siRNA buffer. |
Hiperfect | Qiagen | 301705 | Transfection lipid. |
DMEM | Life Technologies | 41966052 | Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media. |
96 well tissue culture plate | Falcon | 3072 | Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes. |
Packard Viewplate | Perkin Elmer LAS | 6005182 | 96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates. |
Breathable membrane | Alpha Labs | LW2783 | Sterile, gas-permeable, adhesive membrane. |
Neutral buffered formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT5012-1CS | 10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100PC | Non-ionic detergent |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | For plate wash solution. |
Anti-P-S780 RB1 antibody | Abcam | ab32513 | Rabbit monoclonal |
AlexaFluor647 Anti-rabbit | Invitrogen | A21245 | Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody. |
Hoechst 33342 (Bisbenzimide) | Sigma-Aldrich | B2261 | Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye. |
Permeabilization solution | NA | NA | 0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0. |
Plate wash solution | NA | NA | Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20. |
Block solution | NA | NA | 5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies. |
Cell Profiler 2.1 | Broad Institute | http://www.cellprofiler.org/download.shtml | |
Active Perl Community Edition | ActiveState | http://www.activestate.com/activeperl/downloads | |
R programming environment | The R Foundation | http://www.r-project.org | |
Rstudio | Rstudio | http://www.rstudio.com/ |