Presenteras är en flexibel informatik arbetsflöde möjliggör multiplex bildbaserad analys av fluorescerande celler. Arbetsflödet kvantifierar nukleära och cytoplasmiska markörer och beräknar markör sloka mellan dessa avdelningar. Förfaranden tillhandahålls för störning av celler med användning av siRNA och tillförlitlig metod för analys av markör detektering genom indirekt immunofluorescens i 96-brunnars format.
Framsteg inom förstå kontrollmekanismer som styr beteendet hos celler i vidhäftande däggdjursvävnadskulturmodeller blir alltmer beroende av former av encelliga analys. Metoder som levererar sammansatta uppgifter återspeglar medelvärden av biomarkörer från cellpopulationer riskerar att förlora subpopulation dynamik som speglar det heterogena studerade biologiska systemet. I linje med detta, är traditionella metoder ersätts av, eller stöds med, mer sofistikerade former av cellulär analys som utvecklats för att möjliggöra en bedömning av hög halt mikroskopi. Dessa analyser potentiellt generera ett stort antal bilder av fluorescerande biomarkörer, vilket möjliggörs genom åtföljande proprietära programvarupaket, tillåter fler parametriska mätningar per cell. Dock har de relativt höga kapitalkostnader och overspecialization av många av dessa enheter hindrade deras tillgänglighet till många utredare.
Beskrivs här är enuniversellt användbar arbetsflöde för kvantifiering av flera fluorescerande markör intensiteter från specifika subcellulära regioner i enskilda celler lämpliga för användning med bilder från de flesta fluorescerande mikroskop. Nyckeln till detta arbetsflöde är genomförandet av den fritt tillgängliga Cell Profiler programvara 1 att särskilja enskilda celler i dessa bilder, segment dem till definierade subcellulära regioner och leverera fluorescens markör intensitetsvärden som är specifika för dessa regioner. Utvinningen av individuella cellintensitetsvärden från bilddata är det centrala syftet med detta arbetsflöde och kommer att illustreras med analysen av styrdata från en siRNA skärm för G1 checkpoint tillsynsmyndigheter i vidhäftande humana celler. Däremot kan arbetsflödet presenteras här tillämpas på analys av data från andra medel för cell störning (t.ex. sammansatta skärmar) och andra former av fluorescensbaserade cellulära markörer och därmed bör vara användbara för ett brett spektrum av laboratorier.
Arbetet presenteras här beskriver användningen av fritt tillgänglig programvara Cell Profiler för att utföra algoritmen styrd fördelning av fluorescerande mikroskopiska bilder av vidhäftande celler för att identifiera enskilda celler och definierade subcellulära regioner. Detta tillvägagångssätt, som kallas bildsegmentering, medger att efterföljande multi parametrisk analys av de avbildade cellerna genom att kvantifiera fluorescensmärkta markörer lokaliserade till varje cell eller subcellulär regionen (kallad segmente objekt). Detta arbetsflöde utgör en grund för att möjliggöra hög innehållsanalys och är avsedd att fungera som ett verktyg som kan vidareutvecklas och modifieras för att passa flera parametriska analyser individuell cell i laboratorier utan tillgång till specialiserade hög halt instrument eller proprietär programvara. Filerna medföljer detta manuskript inkluderar ett test uppsättning relevanta råbilddata, algoritminställningar och stödjande skript för att generera den analys som beskrivs. Den tillhandahålls algoritminställningar feller Cell Profiler är optimerade för de exempeldata som och diskussionsavsnittet detaljer vilka justeringar kan vara nödvändiga för att möjliggöra användning av bilddata från andra studier.
När kvantitativa data har extraherats med hjälp av Cell Profiler, kan olika laboratorier har olika krav på hur man kan använda den information som presenteras av de enskilda cellvärden i rådata; som visas här är ett tillvägagångssätt genom vilket grindar appliceras på rådata för varje analys. Med hjälp av dessa portar, är de data som omvandlas till binära termer av svar, vilket gör visualisering av trender som förbinder olika behandlingar med de subpopulationer av celler som genomgår svar definieras av grindarna. Grindarna sätts utifrån observationer av datafördelning erhållits för lämpliga negativa och positiva kontroller för varje relevant mätning. Användningen av grindar är bara ett exempel på hur man kan hantera de råa, cellbaserade mätningar. Också visas här är användningen av nukleärt DNA intensitet migasurements i sin råa form som en kontinuerlig rad värden i kombination med gated data. Andra tillvägagångssätt för hantering av data bildanalys bör övervägas, beroende på naturen av studien; statistiska alternativ till att använda grindar för att tilldela celler till subpopulationer har rapporterats 2 och systematiska jämförelser av strategier för att sammanfatta data med hög innehålls över ett stort antal parametrar har rapporterats 3.
Hög innehålls analyser av bilddata har funnit användning i cellulära studier av läkemedelssvar, omvända genetik och miljöstress signalering 4-6. Förtjänsten av hög innehållsanalys härrör från det faktum att algoritmisk analys av fluorescensmikroskopi uppgifter möjliggör kvantitativa och rumsliga parametrar som skall beaktas samtidigt över enskilda celler 7. På detta sätt kan cellulära utfall för flera analyser vara korsreferenser, differentiell beteende analys-defined cellsubpopulationer kan spåras inom experimentella förhållanden och analyser kan omfatta granskning av morfologiska variabler. Den strategier och analyser arbetsflöde diskuteras här, som för andra high-innehåll tillvägagångssätt, kan leverera multiplexerade data som kors refererade till enskilda celler. Hög halt metoder kostym studier som genererar fluorescerande mikroskop bilder och är tillämpliga för analys av data som sträcker sig från tiotals bilder som produceras i låg genomströmning konventionell fluorescens-baserade mikroskopi genom de tusentals bilder som framställts med hjälp av automatiserade hög halt screening plattformar.
Arbetsflödet illustreras här med exempeldata från vilka separata analyser mäts i termer av antingen kärn fluorescerande markör intensiteter eller nukleär / cytoplasma translokation av ett fluorescerande reporter protein, respektive. Arbetsflödet är flexibel i att dessa analyser kan behandlas separat eller i kombination beroende på each given frågeställning av olika utredare. De exempeldata produceras som en del av en RNA-interferens (RNAi) experiment (Figur 1). Små störande RNA oligonukleotider (siRNA) används för att VÄLDIGANDE specifika proteiner i HCT116 mänskliga kolorektala cancerceller som resulterar i förändringar för två fluorescerande reportrar av cyklin-beroende kinas (CDK) aktivitet. Den CDK6 beroende fosforylering av kärn retinoblastomprotein vid serin 780 (P-S780 RB1) bedöms av antikroppsfärgning. I samma celler, är ett grönt fluorescerande protein-märkta reporter av CDK2-aktivitet (GFP-CDK2 reporter) bedöms av landets kärnenergi till cytoplasma förhållandet var i avsaknad av CDK2 aktivitet reportern bosatt i kärnan och vid CDK2 aktiverings skyttlar i cytoplasman 8. Dessutom är det nukleära DNA i varje cell färgas med hjälp av en DNA-interkalerande färgämne, Bisbenzimide, som fungerar som ett sätt att identifiera celler och definiera kärnor gränserna bilderna samt ensa mått av DNA överflöd med information om cellcykelläge av cellen (Figur 2).
Verksamheten i CDK6 och CDK2 är detekterbara som celler transit från G1 till S-fasen av cellcykeln 5 och avlöser varandra 9,10 och som sådan, är nära överensstämmelse mellan de två reportrarna i enskilda celler förväntat. Demonstrationen dataset används här analyser som exempel effekten av siRNA riktar CDK6, retinoblastom protein (RB1) och en icke-inriktning negativ kontroll (tabell 1). Knockdown av CDK6 bör framkalla både en minskning av P-S780 RB1 epitopen och en ackumulering av celler i G1-fasen av cellcykeln. Den RB1 knockdown fungerar som en reagens kontroll för specificiteten hos fosfor-S780 antikropp. Fluorescensmikroskop bilder från formalin fast 11, fluorescerande färgade HCT116 vävnadskulturceller används för algoritmisk bildanalys. Den resulterande numeriska data används sedan för attkorshänvisning reportrarna och bedöma konsekvenserna av de olika knockdown stater.
Den potentiella storleken på de data som produceras av denna typ av analys kan presentera en utmaning till normala analysverktyg. Till exempel kan de individuella celldata vara större än vissa kalkylprogram kommer att rymma. Inkluderat är Perl-skript som utför enkla, högt repetitiva, övervakad behandling av uppgifter för att underlätta analys av stora datamängder. De Perl-skript är skrivna speciellt för de utgående filer som produceras av Cell Profiler, när de behandlar bildfiler med en specifik fil namnkonvention (Figur 3), och möjliggör variabla antal fält per brunn som ska användas i analysen. Det är ofta viktigt att grinden individuell cell analysuppgifter för att spåra trender i cellsubpopulationer 5 och visas här är användningen av ett Perl-skript för att flagga varje cell baserat på en uppsättning grind förutbestämd för varje analys typ. Ingår även valfria Perl-skriptsom sammanfattar uppgifterna utfallet för enskilda brunnar (eller villkor), leverera: andelen celler inom den inställda grinden och medelvärdena för de råa analys poängen. Den senare, mer homogena sätt att visa data, är giltigt där svaren påverkar alla eller de flesta celler i en brunn. Som diskuterats ovan, är mindre användbar än den som ges av den enskilda cellen uppgifter gating där svar begränsas till en delmängd av celler inom en population sådan bedömning.
Nyttan av den beskrivna arbetsflödet är inte begränsad till störning av siRNA eller marköranalyser beskrivna. Studier har använt denna metod för att analysera svaren i vävnadskultur experiment med kombinationer av siRNA, kemiska hämmare och strålbehandling samt för bedömning av andra än CDK6 markörer och CDK2 aktivitet 5.
Begreppsmässigt låter den experimentella strategin en mängd biologiskt användbara subcellulära regioner som skall registreras automatiskti enskilda celler som finns i fluorescerande mikroskop bilder. Som sådan, kan detta tillvägagångssätt ge kvantitativa, multiplexade uppgifter avslöjar biologisk information som kan missas genom tekniker som fokuserar på populationer snarare än enskilda celler. Med smärre modifieringar, kan den metod och analys arbetsflöde beskrivs ge kvantitativa, individuella celldata för eventuella fluorescensbaserade analys utgångar och cellbiologiska reaktioner, där kvantitativ bedömning av DNA-innehåll, kvantifiering av kärnkraft eller cytoplasmatisk fluorescens eller skytt av markörer mellan dessa två fack, antingen individuellt eller i ett multiplex sätt är av intresse. Som förlags krav tenderar alltmer mot inlämnande av öppet tillgängliga rådata, tillgång till och förtrogenhet med gratis verktyg för mikroskopi bildanalys såsom de som beskrivs här kommer också att vara av direkt intresse för labb som vill omanalysera publicerade data.
Arbetsflödet beskrivs utgör ett förfarande för flerkälls perturbance av celler genom att använda siRNA, efterföljande markör upptäckt och äntligen använda av en serie mjukvarustödda åtgärder för att underlätta utvinning av kvantitativa data från de resulterande fluorescerande mikroskopiska bilder. Ansatsen är inriktad på leverans av nukleära och cytoplasmiska intensitetsvärden för enskilda celler, som har bred praktisk tillämpning i många cellbaserade applikationer. De exempeldata som används här genererades i en siRNA skärminställning där två fluorescerande analyser för G1 fas cellcykelns transitering testas och korrelerade tillbaka till en mer direkt biofysiska mått på kärn DNA-innehåll.
Användningen av ett fluorescerande DNA fläck till bilden kärn-DNA är ett nödvändigt steg i bildsegmente processen eftersom det möjliggör identifiering av enskilda celler och den resulterande "Nuclei mask" tjänar som utgångspunkt för att identifiera motsvarande cytoplasmiC-regioner. GFP-tagged CDK2 reporter, som stabilt uttrycks i cellerna, ger en variabel ännu genomgående högre än bakgrundssignalen i cytoplasman genom vilket detta fack kan avgränsas. Samma pipeline analys bör vara tillämplig på analys av proteintransloka händelser med hjälp av andra lämpliga fluorescens bundna reportrar och deras svar på perturbance. Dessutom skulle substituera GFP-CDK2-reporter med cytoplasma specifika fluorescerande färgämnen tillåta alternativ användning av denna algoritm för att mäta dimensionerna av cytoplasma och de relativa storlekarna för cellerna i bilderna.
En annan utformning övervägande i bildsegmentestrategi som beskrivs här är att använda Cell Profiler för att leverera integrerade intensitetsvärden för DNA kvantifiering. Integration av intensiteten värden för nukleärt DNA färgnings uppgifter möjliggör möjliga variationer i nucleus storlek, och representerar en nära match för kvantifiering profilerna settför propidiumjodid målat FACS data. Dock kan integrerade intensiteten inte ge ett lämpligt medel för att bedöma proteinfunktion där den genomsnittliga koncentrationen, exemplifierad av medelintensitet antigen fluorescens, är mer biologiskt relevant än den integrerade totala mängden protein (och tillhörande fluorescens) inom en cell fack. Därför menar intensitetsvärden användes för P-S780 RB1 och GFP uppgifter. Alternativet att ändra mellan de två lägena (betyder eller integrerad) data bedömning finns på "ExportToSpreadsheet" panel Cell Profiler programvara.
Inställningarna analys i 3_channels_pipeline.cppipe filen är optimerade för bilderna i uppsättningen exempeldata. Analys av nya bilder set med detta protokoll kommer att kräva att filnamnen antar namnkonventionen som beskrivs ovan (Figur 3). Dessutom värderar känslighet för att passa ljusstyrka nukleärt DNA färgning och trösklar för bakgrundintensiteter i de nya bilduppsättningar kan behöva justeras inom Cell Profiler inställningar. Med tanke på den nyckelroll DNA färgning håller för att bygga de olika bildsegmente masker, är tillämpningen av korrekta känslighetsinställningar för den här kanalen nyckeln till en framgångsrik analys av nya bilddata med Cell Profiler programvara. Den tillhandahålls Cell Profiler inställningsfil (3_channels_pipeline.cppipe) innehåller anteckningar om de oftast användbara parametrar för att anpassa analysen till nya uppgifter. Dessa anteckningar är i textrutan längst upp på skärmen i Cell Profiler i huvudfönstret och inkludera riktlinjer om att ändra känslighetsinställningar och justera antalet kanaler som ska analyseras. Som åtalade i protokoll avsnitt 2.8, för att testa inställningarna för nya bilddata kan det vara nödvändigt att observera bildsegmente under bildanalys genom att klicka öppna de "ögon" ikoner för varje "Identifiera … Objekt" protokollsteg (figur S1D </strong>). I synnerhet kommer visualisering av bilddata genom "IdentifyPrimaryOjects" visar om Nuclei masken korrekt identifierats från bilder av DNA färgning. På Cell Profiler mjukvarusidan för de "IdentifyPrimaryOjects" modul är tröskelkorrektionsfaktor. Trial and error justering av detta värde kommer att fixa de flesta kärnkrafts fel erkännande. Värdena balansera DNA-kanalen mot bakgrund intensiteten för varje bild. Tröskelkorrigeringsfaktorvärden gångjärn runt 1, där större än detta är strängare (bra för tydliga bilder) och mindre än 1 är seende (anpassad till bilder med mindre kontrast mellan färgning och bakgrund).
Den råa produktionen av enskilda celldata från Cell Profiler kan analyseras på olika sätt för att passa behoven hos andra studier. Visas här är användningen av ett Perl-skript för att tillämpa portarna till två av de parametrar som mäts per cell för att bistå utvinna biologiska trender från data ettd tillstånd samkörning av de identifierade subpopulationer med ytterligare mätningar. Även om det är lika möjligt att inkludera delar av grind inom ramen för Cell Profiler, den alternativa rutten används här ger större flexibilitet och snabbhet, speciellt om stora datamängder behöver bedömas. Den långsammaste steget i efterbildförvärvsfaser nuvarande protokollet är driften av Cell Profiler programvara. Cell Profiler här drivs utan införande grindar för att alstra en un-gated rådatauppsättning, som kan omanalyseras med den efterföljande Perlskript snabbare och, om så behövs, iterativt med olika grind värden. Inte alla studier vet i förväg lämpliga grind värden som kan variera med reagenser på en viss uppsättning data, och potentiellt över tiden. Det är därför rekommenderat att generera histogram som visar rådata fördelningen erhållits från Cell Profiler för positiva kontroller och mock-störda celler i syfte att identifiera lämpliga gate values för parametrarna av intresse.
De Perl-skript är skrivna för att acceptera en fast definierad kolumnstruktur av data från Cell Profiler och kan sluta fungera om en användare ändrar antalet parametrar produktionen med Cell Profiler hjälp av "ExportToSpreadsheet" inställningar. Att bidra till att genomföra ändringar av inställningarna noterna inkluderas inom Perl skriptfiler. För att se dessa läser manuset i en textredigerare, företrädesvis en programmerare textredigerare inställd på färgkod Perl element (t.ex. http://www.activestate.com/komodo-edit). Dessa anteckningar anger var att justera skript för att anpassa sig till förändringar i dataformat. I likhet med Perl-skript, R-kod fil tillhandahålls (analysis.r), innehåller instruktioner för att rita siffrorna från dataanalys bilden, kan läsas i en textredigerare eller RStudio programvara för att se ytterligare anteckningar om användning och anpassning. Dessa anteckningar kan kompletteras med information om reguljära uttryck och Perl <sup> 12 och ggplot2 13 paket för R, som båda ligger till grund för hur data läses, kommenterad och ritas, respektive.
Nya studier med fluorescensmikroskopi samt rådata som deponerats hos öppen källkod publikationer är mottagliga för analysmetoder såsom de som beskrivs här. Själva karaktären av hög halt uppgifter lämpar sig för rekursiva analys med olika analytiska inriktningar beroende på forskningsintressen given observatör. Även de frågor som kan ställas på de uppgifter som begränsas av proberna ursprungligen använts, bilddata kan ofta menings omanalyseras utanför ramen för de studier som genererade dem.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag CRUK 15043 och CRUK 14251.
Vi tackar Daniel Wetterskog och Ka Kei Ho för tekniskt bistånd och kritisk läsning av manuskriptet.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AllStars negative control siRNA | Qiagen | 1027280 | Negative control siRNA. |
CDK6 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU |
RB1 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT |
5x siRNA buffer | Thermo Scientific | B-002000-UB-100 | To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water. |
Nulcease-free water (non-DEPC) | Applied Biosystems | AM9937 | For dilution of siRNA buffer. |
Hiperfect | Qiagen | 301705 | Transfection lipid. |
DMEM | Life Technologies | 41966052 | Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media. |
96 well tissue culture plate | Falcon | 3072 | Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes. |
Packard Viewplate | Perkin Elmer LAS | 6005182 | 96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates. |
Breathable membrane | Alpha Labs | LW2783 | Sterile, gas-permeable, adhesive membrane. |
Neutral buffered formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT5012-1CS | 10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100PC | Non-ionic detergent |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | For plate wash solution. |
Anti-P-S780 RB1 antibody | Abcam | ab32513 | Rabbit monoclonal |
AlexaFluor647 Anti-rabbit | Invitrogen | A21245 | Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody. |
Hoechst 33342 (Bisbenzimide) | Sigma-Aldrich | B2261 | Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye. |
Permeabilization solution | NA | NA | 0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0. |
Plate wash solution | NA | NA | Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20. |
Block solution | NA | NA | 5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies. |
Cell Profiler 2.1 | Broad Institute | http://www.cellprofiler.org/download.shtml | |
Active Perl Community Edition | ActiveState | http://www.activestate.com/activeperl/downloads | |
R programming environment | The R Foundation | http://www.r-project.org | |
Rstudio | Rstudio | http://www.rstudio.com/ |