جيل المعدلة وراثيا<em> حيدرة</em> من جانب الأجنة حقن مكروي
Summary
Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.
Abstract
As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.
Introduction
وقد استخدمت هيدرا لدراسة التجديد، وتشكيل نمط، والخلايا الجذعية لحوالي 250 سنة 2 هيدرا لديها خطة هيئة بسيطة تتألف من ثلاثة الأنساب الخلية: الظهارية الأديمي الظاهر، الأديم الباطن الظهارية، وفراغي. يتكون الجسم أنبوبي من الأدمة والأنساب الظهارية الأديم الباطن، كل منها عبارة عن طبقة خلية واحدة. كافة الخلايا الظهارية في عمود الجسم هي الإنقسامية. عندما نزحوا الخلايا الظهارية في الأطراف 3، ورئيس (الفم ومخالب) في نهاية شفوية أو القدم (القرص القاعدية) في نهاية مجافي الفم، فإنها تعتقل في المرحلة G2 من دورة الخلية وتغيير مصير الخلايا 4. خلايا النسب الخلالي يقيمون داخل الفجوات بين الخلايا الظهارية. ويدعم هذا النسب من الخلايا الجذعية متعددة القدرات الموجودة في طبقة الأدمة الظهارية العمود الجسم 5. الخلايا الجذعية الخلالي تؤدي إلى ثلاثة سل الجسديةأنواع ل (الأعصاب، وخلايا الغدة، وnematocytes) والخلايا الجرثومية 6،7.
كعضو في بعائلة القراصات، مجموعة شقيقة لجميع bilaterians، يمكن هيدرا تسليط الضوء على العمليات البيولوجية الأساسية المشتركة بين الحيوانات المتعددة الخلايا. حتى وقت قريب، تم عرقلة هذه الجهود من خلال عدم وجود طرق موثوقة لاضطراب في وظيفة الجين. ومع ذلك، مع تطوير منهجية المعدلة وراثيا 1، ونحن الآن قادرون على الاستفادة الكاملة من هيدرا للحصول على فهم أفضل للآليات الأساسية المشتركة بين الحيوانات متعددة الخلايا، مثل وظيفة الخلايا الجذعية، تجديد، والزخرفة. يتم إنشاء خطوط المعدلة وراثيا هيدرا عن طريق الحقن من DNA البلازميد إلى الأجنة، الأمر الذي يؤدي إلى تكامل عشوائي والتعبير خيالية في تردد كبير من سلحفاة صغيرة. يمكن إنشاء خط مع التعبير موحد في نسب معين عن طريق الإكثار اللاجنسي. القدرة على نشر clonally transgشبكة naric هيدرا خطوط هي ميزة على معظم النماذج الحيوانية، والتي يمكن نشرها إلا عن طريق التكاثر الجنسي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تتبع الخلايا المعدلة وراثيا بسهولة في الجسم الحي بسبب شفافية الحيوان وغياب البروتينات الفلورية الذاتية 8.
في سبع سنوات منذ أول خطوط هيدرا المعدلة وراثيا تم إجراؤها 1، وقد تم استخدام هذه الخطوط لمجموعة متنوعة من التطبيقات. جعلت التعبير عن البروتينات الفلورية في أنواع مختلفة من الخلايا من الممكن لتتبع حركة الخلية، ومراقبة التغيرات في شكل الخلية، وتتبع مصائر خلية في كل الظروف نوع البرية وبعد اضطراب كيميائي 1،5،9-12. بالإضافة إلى ذلك، التعبير عن البروتينات الفلورية مختلفة في مختلف الأنساب يسمح لنظام مراقبة الأصول الميدانية عزل السكان خلية معينة. وقد استخدمت هذه التقنية لتسلسل من mRNAs محددة الخلايا الجذعية ونسب محددة الرنا 13،14 صغيرة. بينما مروجيواحد من اثنين هيدرا الجينات الأكتين وقد استخدم على نطاق واسع، وقد تم تحديد عدد قليل خلية من نوع المروجين محددة وتستخدم لدفع التعبير عن GFP المعدلة وراثيا في هيدرا 9،11،15،16. في المستقبل، سوف المروجين الخلية من نوع معين يسمح لمراقبة وجمع أي نوع من الخلايا المحددة. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام نهج المعدلة وراثيا بنجاح لتحديد العناصر التنظيمية رابطة الدول المستقلة تعمل من المروج Wnt3 17.
يوفر تطوير أساليب المعدلة وراثيا في هيدرا نهج قوي لاختبار وظيفة الجينات التي التعبير خارج الرحم، overexpression، وضربة قاضية. وقد بذلت الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الموسومة fluorescently، من أجل دراسة كل وظيفة وتوطين الخلوية 18-20. وبالإضافة إلى ذلك، والتعبير عن دبابيس الشعر RNA في 3'UTR من التحوير GFP يؤدي الى ضربة قاضية من الجينات المستهدفة 21،22. في هذه النهج مطلوب لتحديد GFPوتتبع أنسجة معدلة وراثيا أثناء إنشاء خط المعدلة وراثيا. ومع ذلك، فمن المرجح أن جزيء GFP أن تتدخل في بعض الحالات مع وظيفة البروتين الموسومة. توضح دراسة حديثة أن الجينات هيدرا يمكن ترتيب في تكوين الاوبرون، أي مصنوعة النصوص متعدد المقارين، والتي يتم فصلها بواسطة المهدرجة تقسم بالإضافة زعيم وترجمتها على حدة 23. عن طريق وضع الجينات ترميز البروتين أو دبوس RNA في موقف المنبع من الاوبرون والجين ببروتين في موقف المصب، يمكن للمرء أن تتبع الأنسجة المعدلة وراثيا دون الحاجة لوضع علامة على الجينات التي تشفر البروتين أو RNA القاسي. وقد استخدم هذا الأسلوب لإبداء دبوس RNA في تكوين الاوبرون مع DsRed2 من أجل تحقيق ضربة قاضية الجين 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
هيدرا يستنسخ بشكل روتيني لاجنسيا، ولكنها تتطلب محفزات البيئية للبدء في إنتاج الأمشاج. لا تعرف جيدا هذه المحفزات لمعظم الأنواع وهيدرا قد تختلف من سلالة إلى سلالة. وهناك عقبة كبيرة في إنتاج المعدلة وراثيا هيدرا هو الحصول على الأجنة على أساس منتظم لأنه ق?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل هارولد اند ليلى جائزة G. Y. ماذرز لHL ومنحة المعاهد الوطنية للصحة (R24 GM080527) إلى RESCEJ كان زميل ما بعد الدكتوراه NRSA (NIH F32GM9037222) ويدعم حاليا من قبل على جائزة تنمية عالم أبحاث إرشادهم من الوطني معهد للشيخوخة (K01AG04435). نود أن نشكر المراجعين للتعليقات مفيدة.
Materials
| AEP Hydra Strain | NA | NA | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp |
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
- Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).
- Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. Hydra. Curr Biol. 20, 964-965 (2010).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. Pattern of epithelial cell cycling in hydra. Dev Biol. 148, 602-611 (1991).
- Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra. Differentiation. 35, 181-189 (1987).
- Khalturin, K., et al. Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Dev Biol. 309, 32-44 (2007).
- Bosch, T., David, C. Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells. Dev Biol. 121, 182-191 (1987).
- David, C. N., Murphy, S. Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning. Dev Biol. 58, 372-383 (1977).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464, 592-596 (2010).
- Boehm, A. M., Bosch, T. C. Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra. Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).
- Glauber, K. M., et al. A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra. Development. 140, 4788-4796 (2013).
- Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation. Dev Biol. 313, 13-24 (2008).
- Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra. Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).
- Hemmrich, G., et al. Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity. Mol Biol Evol. , (2012).
- Juliano, C. E., et al. PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).
- Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. Germline stem cells and sex determination in Hydra. Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).
- Milde, S., et al. Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type. Genome Biol. 10, 8 (2009).
- Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).
- Gee, L., et al. beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra. Dev Biol. 340, 116-124 (2010).
- Fraune, S., et al. In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).
- Bridge, D., et al. FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris. PLoS One. 5, e11686 (2010).
- Boehm, A. M., et al. FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).
- Franzenburg, S., et al. MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).
- Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution. PLoS One. 7, e31643 (2012).
- Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. . Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).
- Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells. Dev Biol. 224, 326-338 (2000).
- Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. . Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).
