ट्रांसजेनिक का सृजन<em> हाइड्रा</em> भ्रूण Microinjection द्वारा
Summary
Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.
Abstract
As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.
Introduction
हाइड्रा उत्थान, पैटर्न गठन का अध्ययन, और लगभग 250 साल 2 के लिए स्टेम कोशिकाओं को इस्तेमाल किया गया है हाइड्रा तीन सेल प्रजातियों से मिलकर एक साधारण शरीर की योजना है. बहिर्जनस्तरीय उपकला, endodermal उपकला, और बीचवाला. ट्यूबलर शरीर एक एकल कोशिका परत है, जिनमें से प्रत्येक बहिर्जनस्तरीय और endodermal उपकला प्रजातियों, के द्वारा बनाई है. शरीर स्तंभ में उपकला कोशिकाओं के सभी mitotic हैं. उपकला कोशिकाओं extremities 3 में विस्थापित हो रहे हैं, एबोरल अंत में मौखिक अंत या पैर (बेसल डिस्क) पर सिर (मुंह और जाल), वे सेल चक्र की G2 चरण में गिरफ्तारी और सेल भाग्य 4 बदल जाते हैं. बीचवाला वंश की कोशिकाओं उपकला कोशिकाओं के बीच interstices के भीतर रहते हैं. इस वंश शरीर कॉलम 5 के बहिर्जनस्तरीय उपकला परत में स्थित हैं कि multipotent स्टेम कोशिकाओं द्वारा समर्थित है. बीचवाला स्टेम कोशिकाओं तीन दैहिक सेल को जन्म देएल प्रकार (नसों, ग्रंथि की कोशिकाओं, और nematocytes) और रोगाणु कोशिकाओं 6,7.
जाति नाइडेरिया के एक सदस्य के रूप में सभी bilaterians बहन समूह, हाइड्रा बहुकोशिकीय जानवरों के बीच साझा मौलिक जैविक प्रक्रियाओं पर प्रकाश डाला सकता है. अभी हाल तक, इन प्रयासों जीन समारोह की गड़बड़ी के लिए विश्वसनीय तरीकों की कमी से बाधा गया. हालांकि, ट्रांसजेनिक कार्यप्रणाली 1 के विकास के साथ, हम अब इस तरह के स्टेम सेल समारोह, उत्थान, और patterning के रूप में बहुकोशिकीय जानवरों, को आम बुनियादी तंत्र की एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए हाइड्रा का पूरा लाभ लेने के लिए सक्षम हैं. ट्रांसजेनिक हाइड्रा लाइनों hatchlings का एक बड़ा आवृत्ति में यादृच्छिक एकीकरण और काइमेरिक अभिव्यक्ति में जो परिणाम भ्रूण में प्लाज्मिड डीएनए, इंजेक्शन द्वारा स्थापित कर रहे हैं. एक खास वंश में वर्दी अभिव्यक्ति के साथ एक लाइन अलैंगिक प्रचार के द्वारा स्थापित किया जा सकता है. clonally transg प्रचार करने की क्षमताenic हाइड्रा लाइनों केवल यौन प्रजनन द्वारा प्रचारित किया जा सकता है जो पशु मॉडल का बहुमत है, पर एक फायदा है. इसके अलावा, ट्रांसजेनिक कोशिकाओं के कारण पशु की पारदर्शिता और अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन 8 के अभाव को आसानी से विवो में लगाया जा सकता है.
पहली ट्रांसजेनिक हाइड्रा लाइनों के सात साल बाद ऐसी लाइनों आवेदनों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया गया है, 1 किए गए थे. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति यह संभव, सेल आंदोलन को ट्रैक सेल आकार में परिवर्तन निरीक्षण, और जंगली प्रकार की परिस्थितियों में और रासायनिक गड़बड़ी 1,5,9-12 के बाद दोनों सेल भाग्य को ट्रैक करने के लिए बनाया गया है. इसके अलावा, विभिन्न प्रजातियों में अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति विशेष सेल आबादी के FACS अलगाव के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक को स्टेम सेल विशिष्ट mRNAs और वंश विशेष छोटे RNAs 13,14 के अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया गया है. प्रमोटर की जबकिदो हाइड्रा actin जीन की एक सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है कुछ सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों की पहचान की और ट्रांसजेनिक हाइड्रा 9,11,15,16 में GFP की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. भविष्य में, सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों कोई विशेष सेल प्रकार के अवलोकन और संग्रह के लिए अनुमति देगा. इसके अलावा, एक ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण सफलतापूर्वक Wnt3 प्रमोटर 17 की सीआईएस से अभिनय नियामक तत्वों को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
हाइड्रा में ट्रांसजेनिक विधियों के विकास अस्थानिक अभिव्यक्ति, overexpression, और पछाड़ना द्वारा जीन के समारोह के परीक्षण के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करता है. ट्रांसजेनिक जानवर समारोह और सेलुलर स्थानीयकरण 18-20 दोनों की जांच के क्रम में fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त कि किए गए हैं. इसके अलावा, एक GFP transgene की 3'UTR में शाही सेना hairpins की अभिव्यक्ति लक्ष्य जीन 21,22 के पछाड़ना की ओर जाता है. इन तरीकों में GFP की पहचान करने के लिए आवश्यक हैऔर ट्रांसजेनिक लाइन के निर्माण के दौरान ट्रांसजेनिक ऊतक को ट्रैक. हालांकि, यह कुछ मामलों में GFP अणु टैग प्रोटीन के समारोह के साथ हस्तक्षेप करेगा कि संभावना है. एक ताजा अध्ययन में हाइड्रा जीन एक operon विन्यास में व्यवस्थित किया जा सकता है कि यह दर्शाता है, यानी, polycistronic देखिए तो पार spliced नेता इसके द्वारा अलग और अलग से 23 अनुवाद कर रहे हैं, जो बना रहे हैं. एक प्रोटीन या एक operon और नीचे की ओर स्थिति में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन के अपस्ट्रीम स्थिति में एक शाही सेना बाल के लिये कांटा एन्कोडिंग एक जीन रखकर, एक प्रोटीन या शाही सेना बाल के लिये कांटा एन्कोडिंग जीन टैग करने के लिए बिना ट्रांसजेनिक ऊतक ट्रैक कर सकते हैं. इस विधि जीन 14 पछाड़ना प्राप्त करने के क्रम में DsRed2 साथ एक operon विन्यास में एक शाही सेना बाल के लिये कांटा व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हाइड्रा नियमित अलैंगिक प्रजनन, लेकिन उत्पादन युग्मक शुरू करने के लिए पर्यावरण उत्तेजनाओं की आवश्यकता है. इन उत्तेजनाओं सबसे हाइड्रा प्रजातियों के लिए अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे हैं और ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम RESCEJ को एच एल के लिए एक जी हेरोल्ड और लीला वाई Mathers पुरस्कार और एक एनआईएच अनुदान (R24 GM080527) द्वारा एक एनआरएसए postdoctoral साथी (एनआईएच F32GM9037222) था समर्थित किया गया था और वर्तमान में राष्ट्रीय से एक Mentored अनुसंधान वैज्ञानिक विकास पुरस्कार द्वारा समर्थित है उम्र बढ़ने पर संस्थान (K01AG04435). हम सहायक टिप्पणियों के लिए समीक्षकों को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| AEP Hydra Strain | NA | NA | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp |
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
- Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).
- Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. Hydra. Curr Biol. 20, 964-965 (2010).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. Pattern of epithelial cell cycling in hydra. Dev Biol. 148, 602-611 (1991).
- Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra. Differentiation. 35, 181-189 (1987).
- Khalturin, K., et al. Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Dev Biol. 309, 32-44 (2007).
- Bosch, T., David, C. Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells. Dev Biol. 121, 182-191 (1987).
- David, C. N., Murphy, S. Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning. Dev Biol. 58, 372-383 (1977).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464, 592-596 (2010).
- Boehm, A. M., Bosch, T. C. Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra. Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).
- Glauber, K. M., et al. A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra. Development. 140, 4788-4796 (2013).
- Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation. Dev Biol. 313, 13-24 (2008).
- Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra. Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).
- Hemmrich, G., et al. Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity. Mol Biol Evol. , (2012).
- Juliano, C. E., et al. PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).
- Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. Germline stem cells and sex determination in Hydra. Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).
- Milde, S., et al. Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type. Genome Biol. 10, 8 (2009).
- Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).
- Gee, L., et al. beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra. Dev Biol. 340, 116-124 (2010).
- Fraune, S., et al. In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).
- Bridge, D., et al. FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris. PLoS One. 5, e11686 (2010).
- Boehm, A. M., et al. FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).
- Franzenburg, S., et al. MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).
- Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution. PLoS One. 7, e31643 (2012).
- Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. . Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).
- Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells. Dev Biol. 224, 326-338 (2000).
- Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. . Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).
