Lésion tissulaire ischémique dans le pli de la Chambre Souris Dorsale: Un lambeau de peau modèle pour étudier l'ischémie aiguë et persistante
Summary
La fenêtre de la chambre du pli cutané dorsal murin présenté visualise une zone d'ischémie aiguë et persistante d'un lambeau musculo. Intravitales épi-fluorescence permet de microscopie pour l'évaluation directe et répétitive de la microvascularisation et la quantification de l'hémodynamique. Morphologique et résultats hémodynamiques peuvent en outre être en corrélation avec des analyses histologiques et moléculaires.
Abstract
Malgré expertise profonde et techniques chirurgicales de pointe, les complications induites par ischémie allant de rupture de la plaie à une nécrose des tissus se produisent encore, notamment en chirurgie reconstructive de rabat. Modèles de volets expérimentaux multiples ont été développés pour analyser les causes et les mécanismes sous-jacents et d'étudier les stratégies de traitement pour prévenir les complications ischémiques. Le facteur limitant de la plupart des modèles est la possibilité manque de visualiser directement et de façon répétitive l'architecture microvasculaire et hémodynamique. L'objectif du protocole est de présenter un modèle de souris bien établie affilier ces éléments qui manquent avant mentionnés. Plus difficile et al. Ont mis au point un modèle de lambeau musculo avec un motif de perfusion aléatoire qui subit une ischémie aiguë et persistante et résultats dans ~ 50% de nécrose après 10 jours si elle est conservée non traitée. A l'aide de la microscopie intravitale épi-fluorescence, ce modèle permet la visualisation de la chambre répétitive demorphologie et l'hémodynamique dans différentes régions d'intérêt au fil du temps. Traitements associés tels que l'apoptose, l'inflammation, l'angiogenèse et microvasculaire fuite peuvent être étudiés et corrélés à des dosages de protéines immunohistochimiques et moléculaires. À ce jour, le modèle a prouvé la faisabilité et la reproductibilité dans plusieurs études expérimentales publiées étudier l'effet de pré-, péri- et post-conditionnement de tissu ischémie contestée.
Introduction
Couverture de exposé tendon, de l'os et l'implant en chirurgie reconstructive matériau repose sur l'utilisation de volets. Un clapet est un bloc de tissu qui est transférée sur son pédicule vasculaire qui garantit afflux artériel et le débit sortant veineux. Malgré une vaste expertise et la disponibilité d'une variété de volets à être transférés, les complications induites par ischémie allant de rupture de la plaie à la perte totale du tissu sont encore rencontrés. Tandis que le traitement conservateur et la guérison par seconde intention sont à craindre après une nécrose des tissus mineure, significative nécrose du lambeau nécessite généralement une reprise chirurgicale, y compris le débridement, le conditionnement des plaies et de la reconstruction secondaire. Cela augmente la morbidité, prolonge l'hospitalisation, et par conséquent conduit à une augmentation des coûts de soins de santé.
Volets avec un modèle indéfini de la vascularisation ou zones perfusés de façon aléatoire dans la zone distale la plus éloignée de l'entrée artérielle sont particulièrement sujettes à des lésions ischémiques. Acco rdingly, de nombreuses études expérimentales et cliniques ont évalué le développement d'une nécrose à la fois, les volets de modèle axial (d'approvisionnement en sang défini) et les volets de façon aléatoire (d'approvisionnement en sang non définie) 1-3. Les principaux résultats sont généralement basées sur l'évaluation macroscopique de la taille de la zone nécrotique. Afin d'évaluer les causes et les mécanismes de la nécrose des tissus plus en détail, plusieurs études ont porté sur l'analyse de la microcirculation. Différentes techniques ont été utilisées pour mesurer la perfusion tissulaire, y compris l'analyse de la tension d'oxygène des tissus en utilisant des électrodes polarographiques 4-5, ainsi que la mesure du flux sanguin en utilisant débitmétrie laser Doppler 6-7, colorant diffusion 8, 9 à 10 et des microsphères. Ces techniques, cependant, ne permettent de mesurer des paramètres indirects de la perfusion tissulaire et ne permettent pas une analyse morphologique des procédés microhemodynamic intérieur d'une zone d'intérêt particulier d'un volet.
t "> Sandison est connu pour être le premier qui a utilisé une chambre transparente pour prolonger les études in vivo, qu'il accomplit chez les lapins 11 En 1943 -. environ 20 ans plus tard – Algire fut le premier à adapter une telle chambre transparent pour être applicable chez la souris afin d'étudier le comportement des micro-implants de cellules tumorales 12. En raison du fait que les souris sont les animaux dits de peau lâche et après quelques améliorations techniques au cours des années suivantes, Lehr et collègues ont pu adapter cette une chambre de pli cutané dorsal développement d'une chambre de titane plus petit et plus léger. Cette chambre permet l'évaluation en utilisant la microscopie à fluorescence intravitale, une technique qui permet la visualisation directe et répétitive d'un certain nombre d'morphologiques et microcirculatoires caractéristiques et leur évolution dans le temps dans différentes conditions physiologiques et pathophysiologiques, tels que l'ischémie-reperfusion 13.Dans l'enquête de perfusion de la peau, des muscles et des os volets dans des conditions normales et pathologiques deux tendances se sont produits: d'abord, les modèles «aiguë» des volets qui ne utilisent pas la chambre dorsale du pli cutané comme le pavillon de l'oreille pédiculé chez la souris 14, le lambeau de peau de l'île sur la base latéralement chez le hamster 15 et le volet composite pédiculé chez le rat 16. Deuxièmement, le modèle «chronique» de rabat où la combinaison d'un rabat avec une microcirculation répétitif dorsale plis cutanés chambre des permis des analyses sur plusieurs jours avec la microscopie à fluorescence intravitale. Il se compose d'un lambeau musculo perfusé de manière aléatoire, qui est intégré dans la chambre de pli 17 de la souris. Son rapport largeur-longueur a été choisie d'une situation d'ischémie aiguë et persistante des résultats toujours dans ~ 50% de nécrose des tissus de rabat 10 à 14 jours après rabat élévation. Cette mesure reproductible de nécrose tissulaire permet une évaluation plus poussée des deux, de protection (c.-à-développement de less nécrose) et des facteurs néfastes (par exemple, le développement de plus de nécrose) sur la physiopathologie rabat. Au cours des dernières années, plusieurs publications expérimentales démontrant l'effet de pré différent, péri- et post-conditionnement des procédures, y compris l'administration de substances de tissus de protection 18-24 et l'application locale de facteurs de stress physiologiques tels que la chaleur et des ondes de choc 25 26, ont vu le jour.
Les analyses quantitatives de nécrose, microvasculaire morphologie et paramètres microcirculatoires peuvent en outre être corrélés à des analyses immunohistochimiques et des dosages de protéines. Différentes protéines et des molécules dont le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), oxyde nitrique synthases (NOS), le facteur nucléaire kappa B (NF-kB) et les protéines de choc thermique (HSP-32: l'hème-oxygénase 1 (HO-1) et HSP- 70) se sont avérés jouer un rôle dans la protection des tissus. Sur la base de ce modèle, la chambre de clapet, deux modifications ont été développés in order à analyser la néovascularisation et la microcirculation pendant une greffe de peau guérison 27 et développements angiogéniques dans un lambeau pédiculé avec motif axial perfusion 28. Nous présentons un modèle reproductible et fiable qui comprend un lambeau musculo-ischémie contesté dans la chambre du pli cutané de la souris. Ce modèle permet la visualisation et la quantification de la microcirculation et l'hémodynamique par microscopie intravitale épi-fluorescence.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afin de diminuer les complications ischémiques et ainsi améliorer le résultat clinique, une connaissance plus approfondie des processus physiopathologiques dans le tissu rabat perfusé critique est nécessaire. Le développement de nouveaux modèles animaux qui miment l'ischémie aiguë et persistante est donc obligatoire. En conséquence, nous avons pu développer un modèle facilement reproductible et fiable permettant l'évaluation en temps réel morphologique, dynamique et fonctionnel répétitif de diver…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Katharina Haberland pour l'édition d'image. Financement: L'auteur principal a reçu une subvention de la KKF Technische Universität München à mettre en place un nouveau laboratoire de recherche.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
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