マウスの背部皮脂商工における虚血性組織損傷：皮膚弁モデル急性永続虚血を調査する
Summary
提示されたマウス背側皮下脂肪チャンバーのウィンドウには、筋皮弁の急性永続的虚血のゾーンを可視化する。微小血管系および血行動態の定量化の直接的かつ反復的な評価のための生体エピ蛍光顕微鏡許す。形態学的および血行動態の結果は、さらに組織学的および分子解析と相関させることができる。
Abstract
深い専門知識と高度な外科技術にもかかわらず、大規模な組織壊死に巻か内訳に至るまで、虚血誘発性の合併症はまだ特に再建フラップ手術で、発生している。複数の実験的なフラップモデルが根本的な原因およびメカニズムを分析し、虚血性合併症を予防するための治療戦略を調査するために開発されてきた。ほとんどのモデルの制限要因は、直接かつ繰り返し微小血管のアーキテクチャと血行動態を可視化する欠け可能性である。プロトコールの目的は、これらの前述の要素を欠いて提携する十分に確立されたマウスモデルを提示することであった。ハーダーらは、未処理保つ場合、10日後に50％の壊死〜急性永続的虚血および結果を受けてランダム灌流パターン筋皮弁のモデルを開発した。生体落射蛍光顕微鏡を用いて、このチャンバモデルは、反復的な可視化を可能にする時間の経過とともに関心の異なる領域における形態および血行動態。アポトーシス、炎症、微小血管漏出および血管新生などの関連プロセスを検討し、免疫組織化学、分子、タンパク質アッセイに相関させることができる。現在までに、モデルは虚血挑戦組織の前、閉経期の影響とポストコンディショニングを調査いくつかの公表の実験的研究で実現可能性と再現性を証明しています。
Introduction
再建手術でさらさ腱、骨とインプラント材料の被覆率は、フラップの使用に依存している。フラップは、動脈流入および静脈流出を保証し、その血管茎上で転送された組織のブロックです。幅広い知識と転送されるフラップの様々な利用可能性にもかかわらず、創傷の破壊からの全組織喪失に至る虚血誘発性の合併症がまだ遭遇している。二意思による保存的治療と治癒がマイナー組織壊死後に期待することができるが、かなりのフラップ壊死は通常デブリードマンを含め、外科的改正が必要で、エアコン、二次再建を巻か。これは、罹患率が増加し入院を延長し、その結果、増加した医療費につながる。
動脈流入から最も離れた遠位のゾーン内の血管系の未定義のパターン、またはランダムに灌流領域を有するフラップが虚血性損傷を特に受けやすい。 ACCO rdingly、多数の実験的及び臨床的研究は、軸方向のパターンフラップ（定義された血液供給）及びランダムパターンフラップ（未定義の血液供給）1-3両方に壊死の進行を評価した。主な結果は、一般的に壊死領域のサイズの巨視的評価に基づいている。より詳細には組織壊死の原因とメカニズムを評価するために、いくつかの研究は、微小循環の分析に焦点を当てた。別の技法は、ポーラログラフ電極4-5と同様に、レーザードップラーフローメトリ6-7、染料拡散8、およびミクロスフェア9-10を使用して血流の測定を用いて組織の酸素分圧の分析を含む、組織潅流を測定するために使用されてきた。これらの技術は、しかし、唯一の組織灌流の間接的なパラメータを測定可能にし、フラップの関心のある個々の領域内microhemodynamicプロセスのいずれかの形態学的分析を可能にしない。
T ">サンディソンは、彼がウサギ11で行われるin vivo試験において 、長期化のための透明容器を使用した最初の人であることが知られている1943年- 。約20年後- Algireは適用可能であることがこのような透明チャンバーを適合させることが第一号だった腫瘍細胞は12のマイクロインプラントの挙動を研究するために、マウスにおける。によりマウスがたるんだ皮膚動物いわゆるされ、次の数年にわたって、いくつかの技術的改良の後、レアーおよび共同研究者は、適合させることができたという事実に小型·軽量チタンチャンバーを開発して背側皮下脂肪チャンバーは、このチャンバーは、生体内蛍光顕微鏡、形態学的および微小循環機能の数と異なる生理学的および病態生理学的条件の下で時間をかけてその変化の直接的かつ反復的な可視化を可能にする技術、そのようなを用いた評価を可能に虚血再灌流障害として13。PEの研究では正常および病的条件下では皮膚、筋肉や骨フラップのrfusionは2つの傾向が発生しました。まず、マウス14で有茎耳フラップとして背側皮下脂肪チャンバーを使用しない「急性」フラップモデル、横方向に基づいて、島皮弁をハムスター15及びラット16における有茎複合フラップで。第二に、背側皮下脂肪チャンバー許可反復微小循環とフラップの組み合わせが生体内蛍光顕微鏡で数日にわたって分析して「慢性」フラップモデル。それは、マウス17の皮下脂肪チャンバー内に統合されて、ランダムに灌流さ筋皮弁で構成されています。その幅対長さの比は、急性持続性の虚血の状況が一貫して10〜14日フラップ上昇した後、50％フラップ組織壊死〜になるように選択した。組織壊死のこの再現性の程度は、保護（ すなわち 、開発のレ両方のさらなる評価を可能にするS壊死）と有害な因子（ すなわち、フラップ病態生理の詳細壊死の開発）。最後の年の間に、別の閉経前、および組織保護物質18-24を投与すると、熱25および衝撃波26などの生理的ストレッサーのローカルアプリケーションを含む、ポストコンディショニング手順、の効果を実証するいくつかの実験の出版物、浮上している。
壊死、微小血管形態および微小循環のパラメータの定量分析は、さらに、免疫組織化学的分析およびタンパク質アッセイに相関させることができる。ヘムオキシゲナーゼ1（HO-1）及びHSP-：血管内皮増殖因子（VEGF）、一酸化窒素合成酵素（NOS）、核因子カッパB（NF-κB）および熱ショックタンパク質（HSP-32を含む種々のタンパク質および分子70）組織保護において役割を果たすことが示されている。このチャンバーフラップモデルに基づいて、2つの修正は、オードが開発されているR皮膚移植治癒27と軸パターン灌流28と有茎フラップにおける血管新生の開発中に新生血管形成および微小循環を分析すること。我々は、マウスの皮下脂肪チャンバー内の虚血挑戦筋皮フラップを含み、再現性と信頼性モデルを提示。このモデルは、生体エピ蛍光顕微鏡により微小循環と血行動態の可視化および定量化を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
虚血性合併症を減少させ、それによって臨床結果を改善するために、決定的に灌流フラップ組織における病態生理学的プロセスのより詳細な知識が必要である。急性持続性の虚血を模倣する新規の動物モデルの開発が必須である。したがって、我々は、サンプリングされたフラップ組織の免疫組織化学的および分子解析と相関させることができる筋肉と皮膚血管系の種々のパラメータを繰り?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、画像編集用のカタリーナHaberlandに感謝します。資金は：筆頭著者は、新しい研究室をセットアップするためにミュンヘン工科大学からKKFグラントを受け取った。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
