Lesão tecido isquêmico na Skinfold Câmara do mouse Dorsal: Um Modelo retalho de pele para investigar aguda isquemia persistente
Summary
A janela da câmara de dobras cutâneas dorsal murino apresentado visualiza uma zona de isquemia aguda persistente de um retalho musculocutâneo. Intravital epi-fluorescência licenças de microscopia para avaliação direta e repetitiva da microcirculação e quantificação de hemodinâmica. Morfológica e resultados hemodinâmicos podem ainda ser correlacionados com análises histológicas e moleculares.
Abstract
Apesar de profunda experiência e técnicas cirúrgicas avançadas, complicações induzidas por isquemia que variam de quebra ferida à extensa necrose dos tecidos ainda estão ocorrendo, particularmente na cirurgia de retalho reconstrutiva. Vários modelos experimentais de aba ter sido desenvolvido para analisar mecanismos e causas subjacentes e para investigar as estratégias de tratamento para prevenir complicações isquémicas. O fator limitante de a maioria dos modelos é a possibilidade de falta direta e repetidamente visualizar a arquitetura microvascular e hemodinâmica. O objetivo do protocolo é apresentar um modelo de rato bem estabelecida filiar esses elementos que faltam antes mencionados. Mais difícil et ai. Desenvolveram um modelo de uma aba musculocutaneous com um padrão aleatório de perfusão que sofre de isquemia e os resultados persistente aguda em ~ 50% de necrose depois de 10 dias se mantido não tratado. Com o auxílio de microscopia de epi-fluorescência intravital, este modelo de câmara permite a visualização repetitiva demorfologia e hemodinâmica em diferentes regiões de interesse ao longo do tempo. Processos associados, tais como apoptose, inflamação, o vazamento microvascular e angiogênese pode ser investigado e correlacionados com ensaios de proteína imuno-histoquímica e molecular. Até o momento, o modelo provou viabilidade e reprodutibilidade em vários estudos experimentais publicados que investigam o efeito do pré, peri e pós-condicionamento de tecido isquemicamente desafiado.
Introduction
Cobertura de material de tendão, osso e implante exposto em cirurgia reconstrutiva depende da utilização de abas. Uma aba é um bloco de tecido que é transferido no seu pedículo vascular que garante influxo arterial e retorno venoso. Apesar da perícia e da ampla disponibilidade de uma variedade de abas sejam transferidos, complicações induzidas por isquemia que variam de desagregação da ferida para a perda de tecido total ainda são encontrados. Considerando o tratamento conservador e cicatrização por segunda intenção pode ser esperada após necrose do tecido menor, necrose significativa geralmente requer revisão cirúrgica, incluindo desbridamento, condicionamento de feridas e reconstrução secundária. Isso aumenta a morbidade, prolonga a internação e, conseqüentemente, leva ao aumento dos custos de cuidados de saúde.
As abas com um padrão indefinido de vasculatura ou áreas perfundidos aleatoriamente na zona distal mais afastada do influxo arterial são particularmente propensas a danos isquémico. Acco rdingly, numerosos estudos experimentais e clínicos têm avaliado o desenvolvimento de necrose em ambos, retalhos de padrão axial (fornecimento de sangue definido) e retalhos de padrão aleatório (fornecimento de sangue indefinido) 3/1. As principais conclusões são comumente baseado na avaliação macroscópica do tamanho da área de necrose. A fim de avaliar as causas e os mecanismos da necrose tissular em mais pormenor, vários estudos concentraram-se na análise da microcirculação. Diferentes técnicas têm sido usadas para medir a perfusão tecidual, incluindo a análise da tensão de oxigênio nos tecidos utilizando eletrodos polarográficas 05/04, bem como a medição do fluxo de sangue utilizando dopplerfluxometria a laser 6-7, corante difusão 8, e microesferas 10/09. Estas técnicas, no entanto, só permitem a medição de parâmetros indiretos de perfusão tecidual e não permitir qualquer análise morfológica dos processos microhemodynamic dentro de uma área individual de interesse de um retalho.
t "> Sandison é conhecida por ser a primeira que tenha usado uma câmara transparente prolongada para estudos in vivo, o que ele realizados em coelhos 11 Em 1943 -. cerca de 20 anos mais tarde – Algire foi o primeiro a se adaptar uma câmara, de modo transparente para ser aplicável em camundongos, a fim de estudar o comportamento de micro-implantes de células tumorais 12. Devido ao fato de que os ratos são os chamados animais de pele solta e depois de alguns aperfeiçoamentos técnicos ao longo dos anos seguintes, Lehr e colegas de trabalho foram capazes de adaptar tais uma câmara de dobras cutâneas dorsal desenvolver uma câmara de titânio menor e mais leve. Esta câmara permitiu a avaliação em microscopia de fluorescência intravital, uma técnica que permite a visualização direta e repetitiva de uma série de características morfológicas e da microcirculação e suas mudanças ao longo do tempo, em diferentes condições fisiológicas e fisiopatológicas, tais como a lesão de isquemia-reperfusão 13.Na investigação de perfusion de pele, músculo e osso abas em condições normais e patológicas duas tendências ocorreu: Em primeiro lugar, os modelos aba "aguda" que não usam a câmara prega dorsal, como a aba lateral pediculado no camundongo 14, o retalho ilha da pele com base lateralmente no hamster 15 e do retalho pediculado composto em ratos 16. Em segundo lugar, o modelo flap "crônica", onde a combinação de um retalho com dobras cutâneas dorsal licenças de câmara microcirculação repetitivo análises ao longo de vários dias, com a microscopia de fluorescência intravital. É constituída por uma aba musculocutaneous perfundido aleatoriamente, que está integrado na câmara de dobra cutânea do rato 17. Sua relação largura-comprimento foi escolhido que uma situação de isquemia aguda persistente consistentemente resulta em ~ 50% necrose tecidual aba 10 a 14 dias após a elevação do retalho. Esta medida reprodutível de necrose do tecido permite uma avaliação mais aprofundada de ambos, de proteção (ou seja, o desenvolvimento de less necrose) e factores prejudiciais (isto é, o desenvolvimento de mais de necrose) no fisiopatologia aba. Durante os últimos anos, várias publicações experimentais que demonstrem o efeito do pré-diferente, os procedimentos pós-condicionado, incluindo a administração de substâncias de tecido de proteção 18-24 e aplicação local de estressores fisiológicos, tais como calor e ondas de choque 25 26 peri e, têm surgido.
As análises quantitativas de necrose, morfologia microvascular e parâmetros da microcirculação pode ainda ser correlacionada com as análises de imuno-histoquímica e testes de proteína. Proteínas e moléculas diferentes, incluindo o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), sintases de óxido nítrico (NOS), factor nuclear kappa B (NF-kB) e proteínas de choque térmico (HSP-32: heme oxigenase-1 (HO-1) e HSP- 70) tem mostrado desempenhar um papel na protecção dos tecidos. Com base neste modelo aba câmara, duas modificações têm sido desenvolvidos na order para analisar a neovascularização ea microcirculação da pele durante o enxerto cura 27 e desenvolvimentos angiogênicos em um retalho pediculado com padrão axial perfusão 28. Nós apresentamos um modelo reprodutível e confiável, que inclui uma aba musculocutaneous isquemicamente desafiado na câmara de rato de dobras cutâneas. Este modelo permite a visualização e quantificação da microcirculação e hemodinâmica por microscopia de epi-fluorescência intravital.
Protocol
Representative Results
Discussion
A fim de diminuir complicações isquêmicas e, assim, melhorar o resultado clínico, é necessário um conhecimento mais detalhado dos processos fisiopatológicos em tecido aba criticamente perfundido. O desenvolvimento de novos modelos animais que imitam isquemia aguda persistente, por conseguinte, é obrigatória. Consequentemente, fomos capazes de desenvolver um modelo facilmente reprodutível e fiável que permita a avaliação morfológica em tempo real, dinâmica e funcional repetitiva de vários parâmetros do m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Katharina Haberland para edição de imagem. Financiamento: O autor sênior recebeu uma KKF Grant da Technische Universität München a criação de um novo laboratório de pesquisa.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
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