Lesiones tejido isquémico en la Cámara de los pliegues cutáneos dorsal del ratón: Un modelo de la piel de la aleta para Investigar la isquemia aguda persistente
Summary
La ventana de la cámara de pliegue cutáneo dorsal murino presentado visualiza una zona de isquemia aguda persistente de un colgajo musculocutáneo. Intravital permisos de microscopía de fluorescencia para epi-evaluación directa y repetitiva de la microvasculatura y la cuantificación de la hemodinámica. Morfológicas y resultados hemodinámicos más pueden ser correlacionados con los análisis histológicos y moleculares.
Abstract
A pesar de la experiencia profunda y técnicas quirúrgicas avanzadas, las complicaciones inducidas por la isquemia que van desde la ruptura de la herida a la extensa necrosis de los tejidos siguen ocurriendo, sobre todo en la cirugía de colgajo reconstructiva. Se han desarrollado varios modelos experimentales de solapa para analizar las causas y los mecanismos subyacentes e investigar estrategias de tratamiento para prevenir complicaciones isquémicas. El factor limitante de la mayoría de los modelos es la posibilidad de que carecen para visualizar directamente y repetitivamente arquitectura microvascular y la hemodinámica. El objetivo del protocolo es presentar un modelo de ratón bien establecida afiliarse estos elementos carecen antes mencionados. Harder et al. Han desarrollado un modelo de un colgajo musculocutáneo con un patrón al azar de perfusión que sufre la isquemia aguda y persistente resultados en ~ 50% de necrosis después de 10 días si se mantiene sin tratar. Con la ayuda de intravital microscopía de epi-fluorescencia, este modelo de cámara permite la visualización repetitiva demorfología y la hemodinámica en diferentes regiones de interés con el tiempo. Procesos asociados, tales como la apoptosis, la inflamación, la fuga microvascular y la angiogénesis pueden ser investigados y correlacionados con ensayos de proteínas inmunohistoquímicos y moleculares. Hasta la fecha, el modelo ha demostrado la factibilidad y reproducibilidad en varios estudios experimentales publicados que investigaron el efecto de pre, peri y poscondicionamiento de tejido isquémicamente desafiado.
Introduction
Cobertura de material de tendón, hueso y el implante expuesto en la cirugía reconstructiva se basa en el uso de colgajos. Un colgajo es un bloque de tejido que se transfiere en su pedículo vascular que garantiza el flujo arterial y flujo de salida venoso. A pesar de una amplia experiencia y la disponibilidad de una variedad de aletas para ser transferidos, que aún se registran complicaciones inducidas por la isquemia que van desde la ruptura de la herida a la pérdida total del tejido. Mientras que el tratamiento conservador y la curación por segunda intención se puede esperar después de la necrosis del tejido menor, necrosis del colgajo significativa por lo general requiere revisión quirúrgica, incluyendo el desbridamiento, el acondicionamiento de la herida y reconstrucción secundaria. Esto aumenta la morbilidad, prolonga la estancia hospitalaria y en consecuencia conduce a un aumento de los costos de atención de salud.
Flaps con un patrón definido de la vasculatura o áreas perfundidos al azar en la zona distal más alejada del flujo de entrada arterial son particularmente propensos a daño isquémico. Acco rdingly, numerosos estudios experimentales y clínicos han evaluado el desarrollo de necrosis en tanto, colgajos de patrón axial (suministro de sangre definida) y colgajos de patrón aleatorio (suministro de sangre no definido) 3.1. Las principales conclusiones se basan comúnmente en la evaluación macroscópica de la extensión de la zona necrótica. Con el fin de evaluar las causas y mecanismos de la necrosis de los tejidos más en detalle, varios estudios se centraron en el análisis de la microcirculación. Diferentes técnicas han sido utilizadas para medir la perfusión del tejido, incluyendo el análisis de la tensión de oxígeno del tejido usando electrodos polarográficos 4-5, así como la medición del flujo de sangre usando flujometría láser Doppler 6-7, tinte de difusión 8, y las microesferas 9-10. Estas técnicas, sin embargo, sólo permiten medir parámetros indirectos de la perfusión tisular y no permiten ningún análisis morfológico de los procesos microhemodynamic dentro de una zona individual de interés de un colgajo.
t "> Sandison es conocido por ser el primero que ha utilizado una cámara transparente para prolongada en los estudios in vivo, que se realizó en conejos 11 En 1943 -. aproximadamente 20 años más tarde – Algire fue el primero en adaptar una cámara de tan transparente que es aplicable en ratones con el fin de estudiar el comportamiento de los micro-implantes de células tumorales 12. Debido al hecho de que los ratones son los llamados animales de piel suelta y después de algunas mejoras técnicas en los años siguientes, Lehr y compañeros de trabajo fueron capaces de adaptar tales una cámara de pliegue cutáneo dorsal desarrollo de una cámara de titanio más pequeño y ligero. Esta cámara de activar la evaluación mediante microscopía de fluorescencia intravital, una técnica que permite la visualización directa y repetitiva de un número de características morfológicas y de la microcirculación y sus cambios en el tiempo bajo diferentes condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, tales como la lesión por isquemia-reperfusión 13.En la investigación del PErfusion de colgajos de piel, músculo y hueso en condiciones normales y patológicas dos tendencias se produjo: En primer lugar, los modelos de solapa "agudos" que no utilizan la cámara del pliegue cutáneo dorsal como la oreja pediculado en el ratón 14, el colgajo de piel isla basada lateralmente en el hámster 15 y la solapa de material compuesto pediculado en la rata 16. En segundo lugar, el modelo de aleta "crónica" donde la combinación de una aleta con una cámara lo permite pliegues cutáneos dorsal de la microcirculación repetitivo analiza lo largo de varios días con microscopía de fluorescencia intravital. Se compone de un colgajo musculocutáneo perfundido al azar que está integrado en la cámara de los pliegues cutáneos del ratón 17. Su proporción entre anchura y longitud que se eligió una situación de isquemia aguda persistente como resultado consistentemente en ~ 50% de necrosis tisular aleta 10 a 14 días después de la elevación del colgajo. Esta medida reproducible de necrosis de los tejidos permite una evaluación posterior de ambos, de protección (es decir, el desarrollo de less necrosis) y factores perjudiciales (es decir, desarrollo de más necrosis) en la fisiopatología solapa. Durante los últimos años, varias publicaciones experimentales que demuestren el efecto de diferentes pre, peri y procedimientos post-acondicionamiento, incluyendo la administración de sustancias de protección de tejido 18-24 y la aplicación local de factores de estrés fisiológicos tales como el calor 25 y 26 de ondas de choque, han surgido.
Los análisis cuantitativos de la necrosis, la morfología microvascular y los parámetros de la microcirculación más pueden ser correlacionados a los análisis inmunohistoquímicos y ensayos de proteínas. Diferentes proteínas y moléculas, incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), óxido nítrico sintasas (NOS), factor nuclear kappa B (NF-kB) y proteínas de choque térmico (HSP-32: hemo-oxigenasa 1 (HO-1) y HSP- 70) han sido demostrado que desempeñan un papel en la protección de los tejidos. Basándose en este modelo tapa de la cámara, dos modificaciones se han desarrollado en order para analizar la neovascularización y la microcirculación de la piel durante la cicatrización del injerto 27 y desarrollos angiogénicos en un colgajo pediculado con el patrón axial perfusión 28. Presentamos un modelo reproducible y fiable que incluye un colgajo musculocutáneo isquémicamente desafiado en la cámara de los pliegues cutáneos del ratón. Este modelo permite la visualización y cuantificación de la microcirculación y la hemodinámica por intravital microscopía de epi-fluorescencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con el fin de disminuir las complicaciones isquémicas y así mejorar el resultado clínico, se requiere un conocimiento más detallado de los procesos fisiopatológicos en el tejido perfundido aleta críticamente. El desarrollo de nuevos modelos animales que imitan la isquemia aguda persistente tanto, es obligatorio. En consecuencia, hemos sido capaces de desarrollar un modelo fácilmente reproducible y fiable que permite repetitivo evaluación morfológica, dinámica y funcional en tiempo real de varios parámetros de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Katharina Haberland para la edición de imágenes. Financiación: El autor principal, recibió una subvención de KKF la Technische Universität München, para establecer un nuevo laboratorio de investigación.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
