гДНК Обогащение на транспозазу основе технологии для NGS Анализ всей последовательности<em> BRCA1</em>,<em> BRCA2</em>, и 9 генов, вовлеченных в ДНК Нанесенный Ремонт
Summary
gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Abstract
Широкое использование следующего поколения последовательности открыло новые возможности для исследования рака и диагностики. NGS принесет огромные суммы новых данных по раку, и особенно генетики рака. Современные знания и будущие открытия сделает его необходимо изучить огромное количество генов, которые могут быть вовлечены в генетической предрасположенности к раку. В связи с этим, мы разработали дизайн Nextera учиться 11 полных генов, участвующих в репарации ДНК повреждения. Этот протокол был разработан для безопасного учиться 11 генов (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, Rad50, RAD51C, RAD80, и TP53) от промоутера в 3'-UTR у 24 пациентов одновременно. Этот протокол, основанный на транспозазы технологии и гДНК обогащения, дает большое преимущество с точки зрения времени для генетической диагностики, благодаря отведать мультиплексирование. Этот протокол можно безопасно использовать с гДНК крови.
Introduction
В 2010 году почти 1,5 миллиона человек (в основном женщины) развился рак молочной железы во всем мире. По оценкам, от 5 до 10% из этих случаев были наследственными. Почти 20 лет назад, BRCA1 и BRCA2 были определены как участие в наследственной рака груди и яичников 1. Поскольку около 15 лет назад, BRCA1 и BRCA2 кодирующие области были последовательными, чтобы определить генетическую предрасположенность к груди и рака яичников. Изменения в BRCA1 и BRCA2 обнаруживаются в 10 до 20% отдельных семей 2, предполагая, что анализ этих регионах не является достаточным для эффективного скрининга. В последнее время анализ некодирующих последовательностей (промоутер, интронов, 3-'UTR) от BRCA1 и BRCA2 подчеркнул, что новые мутации / вариации могут быть связаны с более высоким риском рака молочной железы 3-6.
BRCA1 и BRCA2 белки участвуют в гомологичной рекомбинации Ремонт (HHR), который завершается многочисленными партнерами 7. В то время как изменения в генах BRCA1 или BRCA2 вызвать дефекты в репарации ДНК, другие партнеры также могут влиять на риск рака молочной железы. Эта гипотеза представляется, были проверены с BRIP1 8 и PALB2 9 имеют проверенную влияние на рак шейки матки и рака молочной железы, соответственно. Кроме того, два других "умеренного риска" гены предрасположенности рака молочной железы, ATM и CHEK2, также могут быть изучены обычно 10.
Исходя из этих исследований, мы решили разработать протокол для анализа 11 генов (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, Rad50, RAD51C, RAP80, и TP53) у 24 пациентов одновременно, используя очень простой и относительно быстрый протокол на основе транспозазы технологии, с обогащением и секвенирования по средней пропускной устройства. Спасибоэтой методике, то последовательность полные гены от начала промотора до конца 3'-UTR, для RAP80, для которых интронного область 2500 п.н. не была покрыта (CHR5: 176,381,588-176,390,180) исключением. Это представляет в общей сложности около 1000300 б.п. учился с 2734 зондов. Обычно, BRCA1 и BRCA2 экзонных последовательности анализируются Sanger секвенирования, которая нуждается в 1,5 месяцев меньше чем за 20 больных. В соответствии с настоящим протокола (рисунок 1), в то же время, могут быть проанализированы 11 полные гены более 75 пациентов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Широкое использование устройств и технологий NGS предоставил новые возможности в изучении рака и генетических нарушений. В дополнение к целой секвенирования генома или РНК последовательности, анализ большого количества выбранных гДНК последовательностей в многочисленных пациентов ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
Materials
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
| Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3’UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- . The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. BRCA and pancreatic cancer. J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).
