l’enrichissement de l’ADNg pour le séquençage NGS est un outil simple et puissant pour l’étude des mutations constitutionnelles. Dans cet article, nous présentons la procédure pour analyser simplement la séquence complète de 11 gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN.
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Article de méthode
ADNg enrichissement par une technologie basée Transposase-NGS Analyse de la séquence plénier de BRCA1, BRCA2, et 9 gènes impliqués dans la réparation des dommages de l'ADN
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'utilisation généralisée de séquençage de nouvelle génération a ouvert de nouvelles avenues pour la recherche sur le cancer et le diagnostic. NGS apportera d'énormes quantités de données sur le cancer, et en particulier la génétique du cancer. Les connaissances actuelles et des découvertes futures, il sera nécessaire d'étudier un grand nombre de gènes qui pourraient être impliqués dans une prédisposition génétique au cancer. À cet égard, nous avons développé une conception Nextera d'étudier 11 gènes complets impliqués dans la réparation des dommages de l'ADN. Ce protocole a été développé pour étudier en toute sécurité 11 gènes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, et TP53) de promoteur de 3'-UTR chez 24 patients simultanément. Ce protocole, basé sur la technologie de transposase et enrichissement ADNg, donne un grand avantage en termes de temps pour le diagnostic génétique grâce à multiplexage déguster. Ce protocole peut être utilisé en toute sécurité avec ADNg de sang.
Introduction
En 2010, près de 1,5 millions de personnes (essentiellement des femmes) ont développé un cancer du sein dans le monde entier. On estime que 5 à 10% de ces cas étaient héréditaires. Il ya près de 20 ans, BRCA1 et BRCA2 ont été identifiées comme impliquées dans héréditaire du sein et des ovaires 1. Depuis environ 15 ans, les régions codantes des gènes BRCA1 et BRCA2 ont été séquencés afin de déterminer la prédisposition génétique au cancer du sein et le cancer de l'ovaire. Des altérations dans les gènes BRCA1 et BRCA2 sont détectés chez 10 à 20% de deux familles sélectionnées suggérant que ....
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Protocole
1 Évaluation des ADNg (ADN génomique) Rendement
- Quantifier fraîchement extrait ADNg avant la préparation de la bibliothèque. Utilisez la méthode d'évaluation du rendement fluorimétrique de quantifier ADNg intact (éviter d'utiliser un spectrophotomètre pour ADNg évaluation de rendement). Mesurer la (260/280 nm) rapport et s'assurer qu'il est compris entre 1,8 et 2 NOTE: 50 ng de ADNg sont nécessaires pour l'expérience.
2. ADNg Enrichissement: Jour 1, Matin
- Avant de partir
- De la trousse d'enrichissement de l'ADN (voir le tableau des Matériaux / Équipement), dégel tampon d'....
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Résultats
Exemple QC Résultats
La capacité de cette méthode pour déterminer des séquences de gènes cibles est basée sur la qualité de l'ADNg (figure 2A) et la qualité de l'étape de tagmentation. Si le tagmentation n'est pas suffisante (Figure 2B, panneau supérieur), le séquençage ne sera pas satisfaisante. Comme mentionné ci-dessus, après la purification de tagmentation, l'ADNg doit être tagmented en fragments de 150 pb à 1000 pb avec la majorité des fragments d'enviro.......
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Discussion
L'utilisation généralisée de dispositifs et de technologies de l'END a offert de nouvelles possibilités dans l'étude du cancer et des maladies génétiques. En plus de séquençage du génome entier ou le séquençage de l'ARN, l'analyse d'une grande quantité de certaines séquences d'ADNg de nombreux patients en même temps offre de grandes perspectives dans le diagnostic. Ici, nous avons développé une conception spécifique (disponible sur demande) en utilisant la technologie Nextera d'étudier 11.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Nous remercions la Ligue contre le Cancer de Côte d’Or et le Centre Georges-François Leclerc pour leur soutien financier. Nous remercions Philip Bastable pour l’édition du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Dispositif de séquençage/moyen débit |
| Nextera Kit d’enrichissement | Illumina | FC-123-1208 | Technologie basée sur la transposase |
| Cartouche 300 cycles | Illumina | 15033624 | |
| Perles AMPure | Beckman Coulter | A63881 | Perles de purification magnétique |
| Support magnétique | Alpaqua | A32782 | |
| Plaques à 96 puits Life | Technologies | 4306737 | |
| MIDI Plaques à 96 puits | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | Ce joint n’est nécessaire que pour l’amplification par PCR. D’autres joints standard peuvent être utilisés tout au long de l’expérience |
| MiSeq | Illumina | Fourni avec le dispositif de séquençage Logiciel Experiment Manager Adresse Internet : http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Outil du site Web du fabricant |
Références
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
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Réimpressions et autorisations
