gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Het wijdverbreide gebruik van Next Generation Sequencing heeft opengesteld nieuwe mogelijkheden voor onderzoek naar kanker en de diagnose. NGS zal enorme hoeveelheden nieuwe gegevens over kanker, en in het bijzonder de genetica van kanker te brengen. De huidige kennis en toekomstige ontdekkingen maken het noodzakelijk om een groot aantal genen die betrokken kunnen zijn bij een genetische aanleg voor kanker te bestuderen. In dit opzicht hebben we een Nextera ontwerp om 11 volledige genen betrokken bij DNA schade herstel bestuderen. Dit protocol is ontwikkeld om veilig te studeren 11 genen (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 en TP53) van promotor tot 3'-UTR bij 24 patiënten tegelijk. Dit protocol, gebaseerd op transposasegen technologie en gDNA verrijking, geeft een groot voordeel in termen van tijd voor de genetische diagnose dankzij multiplexing proeven. Dit protocol kan veilig gebruikt worden met bloed gDNA.
In 2010, bijna 1,5 miljoen mensen (voornamelijk vrouwen) ontwikkelden borstkanker wereldwijd. Er wordt geschat dat 5 tot 10% van deze gevallen waren erfelijk. Bijna 20 jaar geleden, BRCA1 en BRCA2 zijn geïdentificeerd als die betrokken zijn bij erfelijke borst-en eierstokkanker 1. Sinds ongeveer 15 jaar geleden, BRCA1 en BRCA2 coderende gebieden werden gesequenced om de genetische aanleg voor borstkanker en eierstokkanker bepalen. Veranderingen in BRCA1 en BRCA2 zijn gedetecteerd in 10 tot 20% van de geselecteerde families 2 suggereert dat de analyse van deze gebieden niet voldoende voor doeltreffende screening. Onlangs heeft de analyse van niet-coderende sequenties (promoter, introns, 3-'UTR) van BRCA1 en BRCA2 benadrukt dat nieuwe mutaties / varianten kunnen worden gekoppeld aan een hoger risico op borstkanker 3-6.
BRCA1 en BRCA2 eiwitten zijn betrokken bij homologe recombinatie Repair (HHR), dat wordt aangevuld met verschillende partners 7. Terwijl veranderingen in BRCA1 of BRCA2 induceren defecten in DNA herstel, kan de andere partners ook invloed op het risico op borstkanker. Deze hypothese lijkt te zijn gevalideerd sinds BRIP1 8 en 9 PALB2 hebben een bewezen effect op baarmoederhalskanker, borstkanker, respectievelijk. Daarnaast zijn twee andere "matig risico" borstkanker gevoelige genen, ATM en CHEK2, kan ook worden routinematig 10 bestudeerd.
In het verlengde van deze studies, hebben we besloten om een protocol tot 11 genen (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 en TP53) bij 24 patiënten te analyseren ontwikkelen tegelijk met behulp van een zeer eenvoudig en relatief snelle protocol gebaseerd op transposasegen technologie, met verrijking en sequencing op een middelgrote doorvoer apparaat. Thanksdeze techniek we de sequentie volledige genen van het begin van de promoter tot eind 3'-UTR, behalve RAP80, waarvoor een intronische gebied van 2500 bp werd niet onder (CHR5: 176,381,588-176,390,180). Dit komt neer op een totaal van ongeveer 1.000.300 bp studeerde bij 2.734 sondes. Gewoonlijk worden BRCA1 en BRCA2 exon sequenties geanalyseerd door Sanger sequentiebepaling, die 1,5 maand nodig voor minder dan 20 patiënten. Met de onderhavige protocol (figuur 1), in dezelfde tijd, 11 volledige genen voor meer dan 75 patiënten konden worden geanalyseerd.
Het wijdverbreide gebruik van NGS apparaten en technologieën heeft nieuwe mogelijkheden in het onderzoek naar kanker en genetische aandoeningen. Naast whole genome sequencing of RNA sequentie, de analyse van een grote hoeveelheid gDNA geselecteerde sequenties in verschillende patiënten tegelijkertijd biedt grote mogelijkheden in diagnose. Hier ontwikkelden we een specifiek ontwerp (op aanvraag) met Nextera technologie om 11 volledige genen tegelijk bestuderen bij 24 patiënten met een gemiddelde throughput sequencing …
The authors have nothing to disclose.
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |