Ett<em> In Vitro</em> Modell för studien av Cellular Patofysiologi i Globoid Cell Leukodystrophy
Summary
Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
Abstract
Den exakta funktionen hos flerkärn mikroglia, som kallas Globoid celler, som är unikt rikligt i centrala nervsystemet hos Globoid cell leukodystrophy (GLD) är oklart. Denna lucka i kunskapen har hindrats av att det saknas en lämplig in vitro-modell för studier. Häri beskriver vi en primär murin glial kultursystem i vilka behandling med psychosine resultat i multinucleation av mikroglia som liknar de karakteristiska Globoid celler funna i GLD. Med hjälp av detta nya system definierade vi förutsättningar och former för analys vid studier av Globoid celler. Den potentiella användningen av denna modell systemet validerades i vår tidigare studie, som identifierade en potentiell roll för matrixmetalloproteinas (MMP) -3 i GLD. Denna nya in vitro-system kan vara en användbar modell där för att studera bildningen och funktion, utan också den potentiella terapeutiska manipulation, av dessa unika celler.
Introduction
Globoid cell leukodystrophy (GLD), även känd som Krabbe sjukdom är en dödlig demyeliniserande sjukdom till följd av förlust av funktionsmutationer i galatocerebrosidase (GalC) gen 1. Den vanligaste formen av GLD är den infantila variant som kännetecknas av debut i den tidiga barndomen och som kännetecknas av en aggressiv klinisk kurs av motoriska och kognitiva försämringar som leder till för tidig död ofta innan fem års ålder 2,3. Genetisk testning används för att verifiera diagnosen GLD 4. Neuropatologi i GLD avslöjar utbredd demyelinisering, neuronal atrofi, astroglios och närvaro av svullna flerkärn mikroglia kallas Globoid celler 5-7. Identifieringen av Globoid celler, ofta innehållande tubulous inneslutningar i deras cytoplasma, har varit ett utmärkande drag för GLD de senaste 97 åren, även om den specifika funktionen av dessa iögonfallande celler har varit svårfångade.
Medverkan av icke-LFöPLsprung Glia (mikroglia och astrocyter) i patogenesen av GLD har länge ansetts vara ett sekundärt gensvar på den djupa demyelinisering i denna sjukdom 8. Intressant, den första beskrivningen av sjukdomen, genom Knud Krabbe 1916 5, rapporterade bildandet av flerkärniga fagocyter som innehåller lipid skräp som har fått namnet "Globoid celler" och är ett kännetecken för denna sjukdom.
Globoid celler är kännetecknande inslag i GLD patologi, även om deras roll i GLD har länge ignorerats. Intressant, dessa celler är bland de tidigaste karakteristiska förändringar i CNS-vävnad i GLD. Denna brist på kunskap kan ha berott på antagandet att bildandet av flerkärniga fagocyter, kallade jätteceller i andra sjukdomar, vanligtvis betraktas som en konsekvens av patologi i stället en initial patogena drivkraft 9. Därför har det funnits få studier som undersöker den mekanism genom which Globoid celler bildas från fagocyter, särskilt i CNS hos GLD. Det förfarande som beskrivs i denna rapport fokuserar på betydelsen av Globoid cellbildning i CNS och vår tidigare demonstration som psychosine-inducerad multinucleation av mikroglia in vitro och dessa celler uppvisade högre nivåer av fagocyterande förmåga. I överensstämmelse med dessa iakttagelser, Globoid celler i twitcher hjärnor innehåller ofta PAS-positiva skräp, vilket tyder på höga nivåer av fagocyterande förmåga. Globoid celler också visat sig vara immunpositiva för ferritin (a mikroglia markör) 10, KP-1 / CD68 (en monocyt markör), och vissa är även positivt för vimentin (en mellanliggande filamentprotein och markör för astrocyter och mikroglia aktiveras) 11, HLA-DRa (en MHCII ytreceptor), och TNF-α 7, och Iba-1 (ett kalciumbindande protein användas för att identifiera mikroglia) 12. Baserat på denna samling av markörer, Globoid celler kommer från mikroglia som utvecklaren unik fenotyp.
Trots deras unika, har den särskilda funktion och bidrag GC till GLD patogenes förbisetts. Globoid celler har tänkt att vara en sekundär konsekvens av kronisk demyelinisering. Däremot har tidigare studier som undersökt den tidsmässigt samman Globoid celler till den vita substansen patologi GLD identifierat förekomsten av Globoid celler i sena embryonala till tidiga postnatala perioder; gånger före oligodendrocyt apoptos och öppen demyelinisering 13. Således föreslår den temporala sekvensen för utveckling av neuropatologi i GLD att Globoid celler bildas i förväg av demyelinisering i denna sjukdom 14. Detta ledde till vår hypotes att den tidiga bildandet av Globoid celler i GLD kan representera ett avgörande patogen händelse snarare än ett sekundärt, reaktiv svar på oligodendrocyt skada 15. Dessutom har dysreglering av microglial aktivitet i GLD ansetts vara en faktiskr att begränsa den långsiktiga effekten av hematopeotic stamcellsterapi för behandling av denna sjukdom 16. Således undersöker de cellulära funktioner och reglering av mikroglia och Globoid celler, som svar på psychosine förväntas ge nya insikter i patogenesen av GLD.
Fram till nyligen hade avsaknaden av en lämplig modell där för att studera Globoid cellbildning begränsat förståelsen av den exakta funktion och bidraget från dessa celler till patologi GLD. I senare studier, bestämdes att Globoid liknande celler kan bildas direkt svar på psychosine, en patogen lipid gift som ackumuleras i GLD. Vi fann att mikroglia, men inte makrofager, aktiveras och omvandlas till Globoid celler i primära gliaceller kulturer som svar på psychosine 15. Denna transformation in Globoid celler befanns vara medierad av den extracellulära proteas, matrix-metalloproteinas (MMP) -3 15. Mer nyligen vihar förlängt dessa resultat och fastställt att psychosine-aktiverade mikroglia och Globoid celler som utvecklats i detta in vitro modellsystem är kraftigt giftiga för oligodendrocyter och oligodendrocyt progenitorceller. Därför, när vägas inom ramen för GLD, den tidiga ansamling av psychosine och bildning av Globoid celler före demyelinisering skulle stödja en framväxande primära och eventuellt patogen roll för mikroglia i denna sjukdom.
Vi föreslår att studier av Globoid cellbildning kommer att avslöja ny information om patogenesen av GLD som kommer att bidra till vår förståelse av denna sjukdom. Dessutom kan denna nya cellulära modell av GLD ge ett nytt format som nya terapeutiska strategier för att hantera sjukliga förändringar i denna sjukdom kunde testas. Därför i denna rapport ger vi ett detaljerat protokoll för utveckling av psychosine-inducerad Globoid celler från primära odlingar av icke myeliniserande glia in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs häri tillhandahåller ett nytt modellsystem där för att studera utvecklingen och funktionell karakterisering av aktiverade mikroglia och Globoid celler. Tidigare arbete av Im et al. med hjälp av en HEK293 cellinje som en mall för utvecklingen av detta protokoll för att studera Globoid cellbildning 21. Det är också viktigt att påpeka att de Globoid celler härledda i modellen skiljer sig från de infödda Globoid celler identifierbara i GLD. Till exempel har vi rutinm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Materials
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
| 40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
| Psychosine | Sigma | P9256 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, 450-454 (2008).
- Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter’s Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
- Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
- Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
- Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
- Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
- Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
- Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
- Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
- Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
- Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
- Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
- Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. , (2013).
- Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
- Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. , (2013).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
- Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
- Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O’Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
