Protein Isolation du développement embryonnaire Souris Coeur Région Valve
Summary
The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.
Abstract
Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.
Introduction
Etre capable d'identifier et de quantifier les niveaux d'expression de protéine est une technique standard pour animale et des expériences basées sur des cellules. Cependant, malgré un intérêt de longue date dans le développement de valve cardiaque embryonnaire précoce, l'évaluation de l'expression des protéines dans ce tissu spécifique au cours du développement est actuellement limité à l'immunohistochimie à la fois le poussin et 1,2 de la souris. Une partie de la difficulté à quantifier l'expression des protéines dans les soupapes de développement de la plupart des organismes modèles (par exemple, poulet et de souris) est la petite taille des vannes, ce qui limite la quantité de protéine qui peut être obtenue. Ainsi, pour des analyses quantitatives, les chercheurs s'appuient généralement sur l'extraction de l'ARN et l'amplification de la PCR quantitative ultérieure ou l'analyse des microréseaux 2-5. Cependant, les niveaux d'expression d'ARN et de protéines ne sont pas entièrement corrélative 6, donc en mettant l'accent sur l'expression de l'ARN ne peuvent pas fournir un compte rendu rigoureux des nombreux changements qui se produisent dans toute signalisation donnévoie à différents moments de l'évolution. Sur la base de cette limite dans la méthodologie actuellement disponibles, l'objectif de cette procédure était de développer un protocole pour obtenir de manière fiable des quantités suffisantes de protéine à partir de la souris embryonnaire régions de valve cardiaque en développement pour l'analyse quantitative des changements qui se produisent dans différentes voies de signalisation qui sont importantes dans la maturation de ce tissu.
Vannes embryonnaires sont déjà couramment disséqués de souris pour l'isolement de l'ARN et l'analyse ultérieure gène d'expression 2-5. Toutefois, ces études ont été limitées à l'utilisation de l'expression des gènes en tant que sortie de lecture de signalisation activation de la voie, ce qui ne permet pas la détection de détecter des modifications post-traductionnelles des protéines qui sont susceptibles d'affecter la signalisation en aval. En utilisant les techniques d'isolation de l'ARN comme un point de départ, nous avons commencé par disséquer les régions d'intérêt. Parce que notre intérêt détectait protéines phosphorylées qui sont des indices de pat signalisationHway activité pendant une période spécifique du développement de la valve aortique (E13.5-14.5), on a effectué toutes les dissections dans du tampon Tris-phosphate libre et recueilli les soupapes dans un tampon de lyse à base de Tris avec des inhibiteurs de phosphatase et protéase. Dans notre cas particulier, que les régions de la valve aortique ont été recueillies, mais la région de la valve pulmonaire peuvent facilement être obtenues en même temps. Les régions de soupapes sont ensuite homogénéisé et combiné avec un tampon d'échantillon qui est actuellement utilisé pour étudier l'expression des protéines dans les valves cardiaques adultes 7. En utilisant des volumes d'échantillon de petite taille (par exemple, 2 pi) et la mise en commun des régions de soupape à partir d'embryons avec le même génotype, nous avons pu détecter des protéines phosphorylées et non phosphorylés à jour embryonnaire 13,5 8. Étant donné que les régions de la vanne peuvent être congelés et stockés dans un tampon de lyse, les embryons peuvent être génotypés si nécessaire avant la mise en commun.
Cette technique élargit l'ensemble des outils qui sont disponibles pour l'évaluation signalin cellulaireg voies au cours du développement et fournit un compliment quantitative de l'immunohistochimie, en particulier pour les valves cardiaques en développement. Cette technique devrait être bénéfique non seulement pour les cardiologues de développement, mais aussi à tous les biologistes du développement qui travaillent avec des embryons de stade précoce sont intéressés dans les régions qui contiennent des tissus limitée.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité à quantifier les niveaux de protéines au début embryon de souris et poussin régions cardiaques de soupape constitue un outil supplémentaire pour comprendre les événements de signalisation cellulaires critiques pour le développement de la vanne. Notre protocole décrit ici ne diffère pas beaucoup de procédures d'isolement de protéines standard. Cependant, en modifiant quelques étapes clés, nous avons réussi à obtenir des protéines phosphorylées de tailles très petits échantillons. Pour…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
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