विकासशील भ्रूण माउस हार्ट वाल्व क्षेत्र से प्रोटीन अलगाव
Summary
The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.
Abstract
Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.
Introduction
प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की पहचान करने और यों करने में सक्षम होने के नाते पशु और सेल आधारित प्रयोगों के लिए एक मानक तकनीक है. हालांकि, के बावजूद एक लंबे समय से वर्तमान में लड़की और माउस 1,2 दोनों में immunohistochemistry तक सीमित है विकास के दौरान इस विशिष्ट ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन, जल्दी भ्रूण हृदय वाल्व विकास में रुचि. सबसे मॉडल जीवों (जैसे, लड़की और माउस) के विकास के वाल्व में प्रोटीन अभिव्यक्ति बढ़ाता की कठिनाई का हिस्सा प्राप्त किया जा सकता है कि प्रोटीन की मात्रा को सीमित करता है जो वाल्व, के छोटे आकार के है. इस प्रकार, मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, शोधकर्ताओं आमतौर पर बाद में मात्रात्मक पीसीआर या माइक्रोएरे विश्लेषण 2-5 के लिए शाही सेना निष्कर्षण और प्रवर्धन पर भरोसा करते हैं. हालांकि, आरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर 6 पूर्ण correlative नहीं हैं, इसलिए शाही सेना अभिव्यक्ति पर ध्यान केंद्रित कर किसी भी संकेत में होते हैं कि कई परिवर्तन का एक कठोर खाते प्रदान नहीं कर सकतेघटनाक्रम के दौरान विभिन्न समय पर मार्ग. वर्तमान में उपलब्ध पद्धति में इस सीमा के आधार पर, इस प्रक्रिया के लक्ष्य को मज़बूती में महत्वपूर्ण हैं कि विभिन्न संकेत दे रास्ते में होने वाले परिवर्तनों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विकासशील भ्रूण माउस हृदय वाल्व क्षेत्रों से प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था इस ऊतक की परिपक्वता.
भ्रूण वाल्व पहले से ही आमतौर पर शाही सेना अलगाव और बाद में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण 2-5 के लिए चूहों से विच्छेदित कर रहे हैं. हालांकि, इन अध्ययनों बहाव के संकेत को प्रभावित कर सकता है कि बाद translational प्रोटीन संशोधनों का पता लगाने का पता लगाने की अनुमति नहीं देता जो मार्ग सक्रियण, संकेत से बाहर पढ़ने के रूप में जीन अभिव्यक्ति का उपयोग करने के लिए सीमित कर दिया गया है. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में शाही सेना के अलगाव की तकनीक का उपयोग करना, हम ब्याज के क्षेत्रों विदारक के साथ शुरू हुआ. हमारे हित phosphorylated प्रोटीन का पता लगाने गया था क्योंकि संकेत पैट की सूचक थी किमहाधमनी वाल्व विकास (E13.5-14.5) की एक विशेष अवधि के दौरान hway गतिविधि, हम फॉस्फेट मुक्त Tris बफर में सभी विच्छेदन प्रदर्शन किया और फॉस्फेट और प्रोटीज inhibitors के साथ एक Tris आधारित lysis बफर में वाल्व एकत्र. हमारे विशिष्ट मामले में, केवल महाधमनी वाल्व क्षेत्रों एकत्र किए गए थे, लेकिन फेफड़े के वाल्व क्षेत्र को आसानी से एक ही समय में प्राप्त किया जा सकता है. वाल्व क्षेत्रों तो homogenized और वर्तमान में वयस्क हृदय वाल्व 7 में प्रोटीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक नमूना बफर के साथ संयुक्त थे. छोटा सा नमूना मात्रा में (उदाहरण के लिए, 2 μl) का उपयोग करते हुए और एक ही जीनोटाइप के साथ भ्रूण से वाल्व क्षेत्रों पूलिंग करके, हम भ्रूण दिन 13.5 8 पर phosphorylated और nonphosphorylated प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम थे. वाल्व क्षेत्रों जमे हुए और lysis बफर में संग्रहित किया जा सकता क्योंकि पूलिंग से पहले की जरूरत है, तो भ्रूण genotyped किया जा सकता है.
इस तकनीक को सेल signalin के मूल्यांकन के लिए उपलब्ध हैं कि उपकरणों के सेट broadensग्राम विकास के दौरान रास्ते और विशेष रूप से विकासशील हृदय वाल्व के लिए, immunohistochemistry के लिए एक मात्रात्मक तारीफ प्रदान करता है. इस तकनीक के विकास के हृदय रोग विशेषज्ञों के लिए बल्कि सीमित ऊतक होते हैं कि क्षेत्रों में रुचि रखते हैं, प्रारंभिक चरण भ्रूण के साथ काम करने वाले सभी विकासात्मक जीव को न केवल लाभ के लिए किया जाना चाहिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
हृदय वाल्व क्षेत्रों जल्दी भ्रूण माउस में प्रोटीन का स्तर यों और लड़की की क्षमता वाल्व विकास के लिए महत्वपूर्ण सेलुलर संकेत घटनाओं को समझने के लिए एक अतिरिक्त उपकरण प्रदान करता है. यहाँ बताया हमारी प?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
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