途上胚性マウス心臓弁地域からのタンパク質の単離
Summary
The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.
Abstract
Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.
Introduction
タンパク質発現レベルを同定および定量化することができることは、動物 – 、および細胞ベースの実験のための標準的な技術である。しかし、開発中にこの特定の組織におけるタンパク質発現を評価し、初期胚心臓弁の開発における長年の関心にもかかわらず、現在、ヒヨコとマウス1,2の両方で免疫組織に限定されている。ほとんどのモデル生物（ 例えば 、ニワトリおよびマウス）の現像バルブにおけるタンパク質発現を定量化することの難しさの一部を得ることができるタンパク質の量を制限するバルブのサイズが小さいことである。このように、定量分析のために、研究者は、一般的に、その後の定量的PCRやマイクロアレイ解析2-5 RNA抽出と増幅に依存しています。しかし、RNAおよびタンパク質発現レベルが6完全相関ではないため、RNA発現に焦点を当てたことは、任意のシグナル伝達に発生する多数の変更を厳密にアカウントを提供することはできません開発中のさまざまな時間での経路。現在利用可能な方法でこの制限に基づいて、この手順の目的は、確実に重要であるさまざまなシグナル伝達経路に発生する変化の定量分析のための現像マウス胎児心臓弁領域からのタンパク質の十分な量を得るためのプロトコルを開発することであったこの組織の成熟。
胚弁はすでに一般的にRNAの単離およびその後の遺伝子発現解析2-5マウスから解剖されています。しかし、これらの研究は、下流のシグナル伝達に影響を与える可能性が翻訳後タンパク質修飾を検出する検出を許可していない経路の活性化をシグナル伝達の読み出しなどの遺伝子発現を使用することに限定されている。出発点として、RNA単離技術を用いて、関心領域を解剖始まった。私たちの関心は、パットのシグナルを示していたリン酸化タンパク質を検出したため大動脈弁の開発（E13.5-14.5）の特定の期間にhway活性は、私たちはリン酸塩を含まないトリス緩衝液内のすべての解剖を実施し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を用いたトリスベースの溶解緩衝液中でバルブを集めた。私たちの特定の場合において、唯一の大動脈弁領域は、収集されたが、肺動脈弁領域を容易に同時に得ることができた。弁領域は、その後、現在成人の心臓弁7におけるタンパク質発現を研究するために使用されるサンプル緩衝液でホモジナイズした後、混合した。少量の試料（ 例えば 、2μl）を使用し、同じ遺伝子型を持つ胚からバルブ領域をプールすることで、私たちは胎生13.5 8でリン酸化および非リン酸化タンパク質を検出することができた。弁領域が凍結し、溶解緩衝液中で保存することができるので、プールする前に、必要に応じて、胚を遺伝子型を決定することができる。
この技術は、細胞signalinを評価するための利用可能なツールのセットを広げるグラム開発中の経路とは、具体的には発展途上心臓弁のために、免疫組織化学への定量的な賛辞を提供しています。この技術は発達心臓専門医にも限定された組織が含まれていた領域に興味を持っている初期段階の胚を扱うすべての発達生物学者のみならず有益である必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
初期胚のマウスとニワトリの心臓弁領域中のタンパク質レベルを定量化する能力は、バルブの開発のための重要な細胞シグナル伝達事象を理解するための追加のツールを提供しています。明細書に記載の当社のプロトコルは、標準的なタンパク質単離手順から大きく異なるものではない。しかし、いくつかの重要な手順を変更することによって、私たちは非常に小さなサンプルサイズからリ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
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