개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리
Summary
The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.
Abstract
Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.
Introduction
단백질 발현 수준을 확인하고 정량 할 수있는 것은 동물성 및 세포 기반 실험을위한 표준 기술이다. 그러나,에도 불구하고 오랜 현재 병아리와 마우스 1, 2 모두에서 면역 조직 화학 염색으로 제한됩니다 개발 과정이 특정 조직에서 단백질 발현을 평가, 초기 배아 심장 밸브 개발에 관심을. 대부분의 모델 유기체 (예, 마우스 및 병아리)의 현상 밸브에서 단백질 발현을 정량화하는 어려움의 일부를 얻을 수있다 단백질의 양을 제한하는 밸브의 작은 크기이다. 따라서, 정량 분석을 위해, 연구원은 일반적으로 다음 정량 PCR이나 마이크로 어레이 분석 2-5 RNA 추출 및 증폭에 의존하고 있습니다. 그러나, RNA 및 단백질 발현 수준은 6 전적으로 상관 아니므 RNA 발현에 집중하면 특정 신호 발생 수많은 변화 엄격한 계정을 제공 할 수 없다개발하는 동안 여러 번 통로입니다. 현재 가능한 방법이 한계에 기초하여,이 절차의 목적은 안정적으로 중요한 다양한 신호 경로에서 발생하는 변화의 정량적 분석을 위해 개발 배아 마우스 심장 밸브 영역에서 단백질의 충분한 양을 획득하기위한 프로토콜을 개발하는 것이었다 이 조직의 성숙.
배아 밸브 이미 일반적으로 RNA 분리 및 후속 유전자 발현 분석을위한 2-5 생쥐 해부된다. 그러나, 이들 연구는 하류 시그널링에 영향을 미칠 수있는 번역 후 단백질 변형을 검출의 검출을 허용하지 않는 경로를 활성화, 신호의 판독으로 유전자 발현을 사용하여 한정 하였다. 출발점으로 RNA 분리 기법을 사용하여, 관심 영역을 해부 시작되었다. 우리의 관심은 인산화 된 단백질을 검출 되었기 때문에 신호 확실 나타내는라고대동맥 판막 개발 (E13.5-14.5)의 특정 기간 동안 hway 활동, 우리는 포스페이트없는 트리스 완충액에서 모두 박리를 수행 프로테아제 및 포스파타제 억제제 트리스 계 용해 완충액에 밸브를 모았다. 우리의 특정 경우에만 대동맥판 영역은 회수하고 있지만, 폐동맥 판막 영역 용이 동시에 얻을 수 있었다. 밸브 영역은 균질화 현재 성인 심장 밸브 (7)의 단백질 발현을 연구하는 데 사용되는 샘플 완충액과 혼합 하였다. 작은 샘플 볼륨 (예를 들어, 2 μL)를 사용하고 동일한 유전자형 배아에서 밸브 영역 풀링함으로써 배아 일 13.5 8에서 인산화 및 비 인산화 된 단백질을 검출 할 수 있었다. 밸브 영역 동결 및 용해 버퍼에 저장 될 수 있기 때문에 풀링하기 전에, 필요한 경우, 배아는 유전자형을 할 수있다.
이 기술은 셀 signalin 평가에 사용할 수있는 툴 세트를 넓게g 개발 중에 경로와 특별히 개발 심장 밸브에 대한 면역 조직 화학 염색에 대한 정량적 칭찬을 제공합니다. 이 기술은 발달 심장병 전문의로뿐만 아니라 제한적인 조직을 포함하는 지역에 관심이있는 초기 단계의 배아에서 작동하는 모든 발달 생물 학자뿐만 아니라 도움이 될 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
심장 밸브 영역을 조기에 마우스 배아 단백질 수준을 정량화하고 병아리 능력 밸브 개발에 중요한 세포 신호 전달 사건을 이해하기위한 추가 툴을 제공한다. 여기에 설명 된 우리의 프로토콜은 표준 단백질 분리 과정에서 크게 차이가 없습니다. 그러나, 몇 가지 주요 단계를 수정하여, 우리는 성공적으로 매우 작은 샘플 크기에서 인산화 단백질을 얻을 수있다. 이 결과를 달성하기 위해, 다음 단?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
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