Gelişmekte Embriyonik Fare Kalp Vana Bölgesi'nde Protein İzolasyonu
Summary
The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.
Abstract
Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.
Introduction
Protein ekspresyon seviyelerini belirlemek ve ölçmek için güçlü olmak bir hayvan ve hücre tabanlı deneyler için standart bir tekniktir. Ancak rağmen uzun süreli bir anda civciv ve fare hem de 1,2 immünohistokimya ile sınırlıdır gelişimi sırasında, bu özel doku içindeki protein ifadesi değerlendirilmesi, erken dönemde embriyo gelişimi kalp kapağı ilgi. En model organizmaların (örneğin, civciv ve fare) gelişmekte vanaları protein ifadesini nicel zorluk parçası elde edilebilir protein miktarını sınırlayan vanalar, küçük boyutu. Böylece, kantitatif analiz için, araştırmacılar genellikle müteakip kantitatif PCR veya mikroarray analizi 2-5 RNA ekstraksiyon ve amplifikasyon güveniyor. Bununla birlikte, RNA ve protein ekspresyon seviyeleri 6 tamamen bağıntılı değildir, bu nedenle RNA ekspresyonu odaklanan herhangi bir sinyal meydana gelen pek çok değişiklik sıkı bir hesap sağlayamazgelişmeler sırasında çeşitli zamanlarda yol. Mevcut metodolojisinde bu sınırı dayanarak, bu prosedürün amacı güvenilir önemli olan çeşitli sinyal yollarında meydana gelen değişikliklere kantitatif analiz için gelişmekte embriyonik fare kalp kapak bölgelerden proteinin yeterli miktarda elde etmek için bir protokol geliştirmek oldu Bu doku olgunlaşması.
Embriyonik vanalar zaten yaygın RNA izolasyonu ve sonraki gen ekspresyon analizi 2-5 için fareden disseke edilir. Ancak bu çalışmalar, akış aşağı sinyali etkileyebilir translasyon sonrası protein modifikasyonları yer tespit algılanmasını izin vermez yolu aktivasyonunun, bir sinyalleme okuma olarak gen ekspresyonu ile sınırlı kalmıştır. Bir başlangıç noktası olarak RNA izolasyon teknikleri kullanarak, ilgi konusu bölgelerin kesme ile başladı. Bizim faiz fosforillenmiş proteinleri tespit Çünkü sinyalizasyon pat göstergesidir olduğunuaort kapak geliştirme (E13.5-14.5) belirli bir süre boyunca Hway aktivitesi, bu fosfat içermeyen Tris tamponu içinde bütün tahlil yapıldı ve fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile bir Tris-bazlı liziz tamponunda valfleri toplanır. Bizim özel durumda, sadece aort kapak bölgeleri toplandı, ancak pulmoner kapak bölgesi kolaylıkla aynı anda elde edilebilir. Valf bölgeleri, homojenize edilir ve şu anda yetişkin kalp valf 7 protein ifadesini incelemek için kullanılan bir numune tampon maddesi ile birleştirildi. Küçük örnek hacimleri (örneğin, 2 ul) kullanılarak ve aynı genotipi ile embriyolardan valf bölgeleri bir araya getirerek, biz embriyonik günde 13.5 8 de fosforlu ve fosforillenmemiş proteinleri tespit başardık. Valf bölgeler dondurulmuş ve lizis tamponunda saklanabilir için araya önce gerekirse, embriyolar genotiplenmiştir edilebilir.
Bu teknik, hücre signalin değerlendirmek için kullanılabilir araçları kümesi genişletmektedirg gelişimi sırasında yollar ve özellikle gelişmekte olan kalp kapakçıkları için, immünohistokimyaya nicel bir iltifat sağlar. Bu teknik gelişim kardiyoloji değil, aynı zamanda sınırlı bir doku ihtiva eden bölümleri ile ilgili erken evre embriyoları ile çalışan tüm gelişim biyolojistlere sadece yararlı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kalp kapak bölgeleri erken embriyonik fare protein seviyelerini ölçmek ve civciv yeteneği vana gelişimi için kritik hücresel sinyal olayları anlamak için ek bir araç sağlar. Burada tarif Bizim protokol standart protein izolasyon prosedürlerinin büyük ölçüde farklı değildir. Ancak, bazı önemli adımları değiştirerek, biz başarıyla derece küçük örneklem büyüklükleri fosforile proteinleri almış. Bu sonucu elde etmek için, aşağıdaki aşamalar, özel bir önem taşımaktadır. Bu kalite…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
- Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
- Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
- Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
- Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Biologie du développement. 386, 385-394 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Development. 127, 1607-1616 (2000).
- Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
- Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).
