보툴리눔 신경독 억제제의 식별을 위해 높은 콘텐츠 이미징 분석
Summary
Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.
Abstract
Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.
Introduction
박테리아 클로 스트 리듐 보툴리눔은 보툴리눔 신경 독소, 1 인간에게 알려진 가장 강력한 생물 독소 중 하나를 생성합니다. 7 별개의 본트 혈청 형 (본트 / AG)이 있습니다. 본트는 / A-담즙으로 인해 SNARE 복잡한 단백질 분해 2,3에 신경 근육 접합부에서 마비를 유도한다. SNARE 단백질 분해는 신경 전달 물질 소포 – 막 융합을 방지하고, 따라서 블록은 신경 전달 물질을 세포 외 유출 (4). 특정 SNARE 목표 중독 과정에 참여 본트 특정 혈청 형에 의존한다. 본트 / A 및 본트 / E 클리브 SNAP-25 본트 / C의 절단 모두 SNAP-25과 신택 5 반면. 또한 소포 관련 막 단백질 (VAMP)라고 나머지 혈청 형 절단하고 시냅 토브 레빈은 (. 본트 / A는 그것이 자연적으로 발생하는 보툴리누스 중독의 높은 비율에 대한 책임으로 분석 개발을위한 선택과 작은 분자의 작용 6. 개발의 가장 긴 기간을 가지고 있었다 본트 / A에 대한 치료제는 주요 목표이다우리의 약물 발견 및 프로그램은, 8-10은 활성 부위의 단백질 분해 효소 억제제 (7)를 식별하는 기존의 목표 기반의 방법을 이용했다. 그러나, 다수의 혈청 형과 노광 후 효능에 대해 넓은 스펙트럼의 활성을 갖는 활성 부위 억제제의 생성 가능성이 문제가 될 것이다.
따라서 우리는 본트 매개 운동 신경 중독을 차단할 수있는 작은 분자를 식별하는 기능을 엔드 포인트로 본트 SNAP-25의 절단을 사용하는 혁신적인 표현형 신약 개발 접근 방식을 구현했습니다. SNAP-25은 생체 내에서 마비와 치사의 예측이다 SNAP-25의 저하와 같은 신경 전달 물질의 방출이 필요합니다. 예를 들어, 세포 기반 스크리닝은 독소를 불 활성화 또는 표적 세포 내 독소 경로의 억제에 대한 책임 세포 요소의 새로운 변조기의 발견으로 이어질 수 있습니다. 표현형 분석 발달에 중요한 요인은 생리적으로 중요한 생물학적 모델의 선택이다. W전자 등은 SNAP-25 11 – 13의 발현을 포함한 일차 운동 신경 세포의 면역 학적 특성을 요점을 되풀이 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 유래 운동 신경을 설명했다. 중요한 것은, 이러한 셀룰러 시스템은 본트 / A 중독에 매우 민감하고 독소 11, 12의 농도 증가에 대한 응답으로 SNAP-25의 용량 의존적 분열을 보여줍니다. 차별화 운동 뉴런은 고 스루풋 플레이트 기반 분석 충분 셀룰러 분석법 어레이의 설계를 허용 양이 생산된다.
표현형 분석은 본트 / 마우스 운동 신경 문화의 중독시 내생 적으로 표현 된 전체 길이 SNAP-25의 분열을 정량화하는 두 가지 항체를 이용한 면역 형광 방법입니다. 단지 전체 길이 SNAP-25를 인식 카복실 말단 본트 / A 분열에 민감한 (BACS) 항체는 SNAP-25의 본트 / A 매개 단백질 분해의 평가를 할 수 있습니다마우스 모터의 발현은 10 뉴런. HCI 분석의 개략도는도 1에 도시된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
보툴리눔 신경 독소와 무기화의 상대적 용이성의 높은 효능 미국 질병 통제 예방 센터에 의해 분류 (가장 높은 우선 순위) biothreat 에이전트로서의 분류 가져왔다. 불행하게도 FDA는 독소는 운동 신경에 의해 내면화 된 후 본트 중독에 대응하기 위해 치료제를 승인하지 있습니다. 본트 중독에서 신경 세포의 회복을 촉진 모든 druggable 메커니즘이 생물학적 위협에 대한 군사 및 공공 모두를 보호하기 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
References
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