ارتفاع الفحص التصوير المحتوى لتحديد البوتولينوم السموم العصبية المانعون
Summary
Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.
Abstract
Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.
Introduction
وبكتيريا كلوستريديوم البوتولينوم تنتج عصبي البوتولينوم، واحدة من السموم البيولوجية أقوى لرجل معروف 1. هناك 7 عترات متميزة بونت (بونت / AG). بونت / A-غال لحث الشلل في الوصل العصبي العضلي بسبب كمين التحلل البروتيني المعقد 2،3. فخ التحلل البروتيني يمنع العصبي-حويصلة الغشاء الانصهار، وبالتالي كتل العصبي إيماس 4. الهدف كمين محدد يعتمد على المصلي بونت معين المشاركة في عملية التسمم. بونت / A وبونت / E يلتصق SNAP-25 بينما يشق بونت / C كلا SNAP-25 و syntaxin 5. الأنماط المصلية المتبقية synaptobrevin يلتصق (وتسمى أيضا الحويصلة يرتبط البروتين غشاء (VAMP). وقد تم اختيار بونت / A للتنمية الفحص كما أنها مسؤولة عن نسبة عالية من التسمم الغذائي التي تحدث بشكل طبيعي ولها أطول مدة العمل 6. تطوير جزيء صغير علاجات ضد بونت / A هو هدف رئيسي لوقد استخدمت لدينا برنامج اكتشاف الأدوية والأساليب التقليدية القائمة على الهدف لتحديد الموقع مثبطات بروتين نشطة 7، 8-10. ومع ذلك، فإن خلق مثبطات الموقع النشطة مع النشاط واسع الطيف ضد الأنماط المصلية متعددة وفعالية بعد التعرض المحتمل أن يكون تحديا.
لذا قمنا بتنفيذ نهج مبتكر اكتشاف المخدرات المظهري يستخدم الانقسام بونت SNAP-25 بمثابة نقطة النهاية وظيفية للتعرف على الجزيئات الصغيرة التي يمكن منع بونت بوساطة تسمم الخلايا العصبية الحركية. مطلوب SNAP-25 لإطلاق الناقلات العصبيه، وتدهور SNAP-25 هو التنبؤية من الشلل والفتك في الجسم الحي. على سبيل المثال، يمكن فحص خلية القاعدة يؤدي إلى اكتشاف جهري جديدة من العوامل الخلوية المسؤولة عن تثبيط سموم أو تثبيط مسارات السم داخل الخلايا المستهدفة. عاملا مهما في تطوير الفحص المظهري هو اختيار النماذج البيولوجية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. Wووصف البريد وغيرها الماوس الجذعية الجنينية (ES) المشتقة من الخلايا العصبية الحركية الخلية التي تلخص الطابع المناعية من الخلايا العصبية الحركية الأساسية، بما في ذلك التعبير عن SNAP-25 11- 13. الأهم من ذلك، هذه الأنظمة الخلوية حساسة للغاية لبونت / A التسمم وتظهر تعتمد على الجرعة الانقسام من SNAP-25 في استجابة لزيادة تركيز السم 11،12. ويتم إنتاج الخلايا العصبية الحركية متباينة أيضا في الكميات التي تكفي لوحة إنتاجية عالية التحليل القائم ويسمح تصميم مجموعة من المقايسات الخلوية.
الفحص المظهري هو طريقة المناعي باستخدام اثنين من الأجسام المضادة متميزة لقياس الانقسام من التطور الطبيعي وأعرب كامل طول SNAP-25 خلال بونت / A التسمم الثقافة الماوس الخلايا العصبية الحركية. وهناك محطة الكربوكسيل بونت / A (باكس) الأجسام المضادة الحساسة للانشقاق الوحيد الذي يعترف كامل طول SNAP-25 تتيح تقييم بونت / A بوساطة التحلل البروتيني من SNAP-25التعبير في الخلايا العصبية الحركية الماوس 10. ويصور رسم تخطيطي للمقايسة HCI في الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
أدى رجولية عالية من أعصاب البوتولينوم والسهولة النسبية للتسليح في تصنيفها ضمن الفئة ألف (أولوية قصوى) وكلاء biothreat من المراكز الامريكية لمكافحة الامراض والوقاية منها. لسوء الحظ، هناك علاجات وافقت ادارة الاغذية والعقاقير لا بونت لمواجهة التسمم بعد أن تم المنضوية السم…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
References
- Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
- Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin. Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).
- Yersin, A., et al. Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).
- Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).
- Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense. Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).
- Nuss, J. E., et al. Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies. Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).
- Opsenica, I., et al. A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus. Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).
- Opsenica, I., et al. The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease. European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).
- Nuss, J. E., et al. Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease. ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem cell research. 6, 195-205 (2011).
- Pellett, S., et al. Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A. Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).
- Fischer, A., et al. Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).
