Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים
Summary
Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.
Abstract
Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.
Introduction
טוקסין החיידק Clostridium מייצר רעל עצב טוקסין, אחד מהרעלים הביולוגיים החזקים ביותר הידוע לאדם 1. ישנם 7 קפסיד bont מובהקים (בונט / AG). בונט / A-גאל לגרום שיתוק בצומת העצבית-שהרירית בשל proteolysis המורכבת מלכודת 2,3. proteolysis המלכודת מונעת איחוי שלפוחית-קרום מוליך עצבי, ולכן לוקים הנוירוטרנסמיטר exocytosis 4. יעד המלכודת הספציפי תלוי בסרוטיפ bont המסוים המעורב בתהליך שכרות. בונט / וונט / E תדבק SNAP-25 ואילו דבק בונט / C שני SNAP-25 וsyntaxin 5. Synaptobrevin ידבק קפסיד הנותרים (המכונה גם חלבון הקרום קשור-שלפוחיות (נצלנית). בונט / נבחר לפיתוח assay כפי שהוא אחראי לשיעור גבוה של בוטוליזם באופן טבעי ויש לו משך הזמן הארוך ביותר של פעולה 6. פיתוח של מולקולה קטנה תרופות נגד ונט / היא מטרה עיקרית לתכנית גילוי תרופות ו נצלה שיטות המבוסס על יעד מסורתיים לזהות מעכבי proteolytic האתר פעילים 7, 8-10. עם זאת, היצירה של מעכבי אתר פעילים עם פעילות קשת רחבה נגד קפסיד מרובה ויעילות לאחר החשיפה צפויה להיות מאתגרת.
לכן יש לנו יישמתי גישה חדשנית, פנוטיפי תרופת גילוי שמשתמשת במחשוף בונט SNAP-25 כנקודת סיום פונקציונלית לזהות מולקולות קטנות שיכול לחסום שיכרון הנוירון מוטורי בתיווך בונט. SNAP-25 נדרש לשחרור הנוירוטרנסמיטר, כהשפלה של SNAP-25 הוא חיזוי של שיתוק וקטלני in vivo. לדוגמא, הקרנה מבוססת תאים עלולה להוביל לגילוי של מאפננים חדשים של גורמים הסלולר אחראים לאיון רעלן או עיכוב של מסלולי רעלן בתוך תאים ממוקדים. גורם חשוב בהתפתחות assay פנוטיפי הוא הבחירה של מודלים ביולוגיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. Wדואר ואחרים תארו את הנוירונים עכבר גזע עוברי (ES) שמקורן בתאים מנוע כי לשחזר את האופי החיסוני של תאי עצב מוטוריים ראשוניים, ובכלל זה הביטוי של SNAP-25 11- 13. חשוב לציין, המערכות הסלולריות אלה רגישות מאוד לונט / שיכרון ולהפגין מחשוף תלוי-מינון של SNAP-25 בתגובה לגידול בריכוזי של רעלן 11,12. הנוירונים המוטוריים המובחן גם הם מיוצרים בכמויות שמספיקות לניתוח מבוסס צלחת תפוקה גבוהה ואפשרו את העיצוב של מערך של מבחני סלולריים.
Assay פנוטיפי הוא שיטת immunofluorescence ניצול שני נוגדנים שונים לכמת מחשוף של באורך מלא בא לידי ביטוי באופן אנדוגני SNAP-25 במהלך ונט / שיכרון של תרבות הנוירון מוטורי עכבר. מסוף carboxyl ונט / נוגדן מחשוף רגיש (BACS) שמכיר באורך מלא רק SNAP-25 מאפשר ההערכה של bont proteolysis תיווך / של SNAP-25ביטוי במנוע עכבר נוירונים 10. תרשים סכמטי של assay HCI מתואר באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
העוצמה הגבוהה של עצבי טוקסין והקלות היחסית של חימושם הביאה סיווגם כקטגוריה (העדיפות הגבוהה ביותר) סוכני biothreat על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן. למרבה הצער, אין FDA אישר תרופה נגד שכרות בונט לאחר רעלן הופנם על ידי תאי העצב המוטוריים. כל מנגנון druggable שמקדם את ההח?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
References
- Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
- Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin. Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).
- Yersin, A., et al. Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).
- Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).
- Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense. Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).
- Nuss, J. E., et al. Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies. Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).
- Opsenica, I., et al. A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus. Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).
- Opsenica, I., et al. The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease. European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).
- Nuss, J. E., et al. Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease. ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem cell research. 6, 195-205 (2011).
- Pellett, S., et al. Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A. Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).
- Fischer, A., et al. Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).
