Une teneur élevée test d'imagerie pour l'identification des inhibiteurs de la neurotoxine botulique

Summary

La neurotoxine botulique est l’une des toxines les plus puissantes parmi les agents de menace biologique de catégorie A, mais il n’existe pas de traitement post-exposition. L’approche d’imagerie à haut contenu est une méthodologie puissante pour identifier de nouveaux inhibiteurs, car elle permet un dépistage multiparamétrique à l’aide de motoneurones biologiquement pertinents, la cible principale de cette toxine.

Abstract

La protéine associée au synaptosomal-25 (SNAP-25) est un composant du complexe soluble du récepteur de la protéine d’attachement NSF (SNARE) qui est essentiel à la libération des neurotransmetteurs synaptiques. La neurotoxine botulique de sérotype A (BoNT/A) est une métalloprotéase de zinc qui bloque l’exocytose du neurotransmetteur en clivant le composant SNAP-25 du complexe SNARE. À l’heure actuelle, il n’existe aucun médicament homologué pour traiter l’intoxication au BoNT/A après internalisation de la toxine par les motoneurones. La mise au point de mesures thérapeutiques efficaces pour contrer l’intoxication par le BoNT/A a été limitée, en partie en raison du manque de tests robustes à haut débit pour le criblage de petites banques de molécules. Nous décrivons ici un test d’imagerie à haut contenu (HCI) utile pour l’identification des inhibiteurs de BoNT/A. Les premiers efforts d’optimisation se sont concentrés sur l’amélioration de la reproductibilité des résultats interplaques à travers plusieurs expériences indépendantes. L’automatisation de l’immunomarquage, de l’acquisition et de l’analyse d’images s’est avérée augmenter la cohérence des tests et minimiser la variabilité tout en permettant l’évaluation multiparamétrique de composés expérimentaux dans un système de motoneurones murins.

Introduction

La bactérie Clostridium botulinum produit une neurotoxine botulique, l'une des toxines biologiques les plus puissants connus à l'homme ^1. Il ya 7 sérotypes distincts de neurotoxines botuliques (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induire une paralysie à la jonction neuromusculaire due à la protéolyse complexe SNARE ^2,3. SNARE protéolyse empêche neurotransmetteur vésicule-membrane fusion et donc blocs neurotransmetteur exocytose ^4. La cible SNARE spécifique dépend du sérotype BoNT notamment impliqué dans le processus d'intoxication. BoNT / A et BoNT / E clivent la SNAP-25 alors que BoNT / C clive les deux SNAP-25 et syntaxin....

Protocol

Plate 20000 différenciées des cellules ES de souris (MES) / puits dans une lysine 96 plaques revêtues de poly-D et ainsi maintenir dans des neurones moteurs milieux de différenciation terminale pour les 7/5 jours.

1. Administration composé et intoxication avec BoNT / A

Effectuer tous les travaux suivants dans un boîtier BSL2 pour maintenir la conformité avec les lignes directrices des CDC / NIH.

1. Préparer 10 mM solutions de chaque composé bibliothèque dans 100% de DMSO en polypropylène plaques à 96 puits. Utilisez le 10 mM à préparer une plaque de dilution intermédiaire qui est 10 fois supérieure à l....

Results

Les données de contrôle hautes et basses créés deux populations distinctes de la différence de deux valeurs médianes supérieures à trois écarts-types (figure 7A). Le but du processus de sélection est de trouver des composés sein de la population de l'échantillon avec des valeurs plus proches de la population de contrôle positif, en supposant une distribution normale au sein de la population de l'échantillon (figure 7B, (i)). Les points de données qui sont 3 écarts-types au-delà de la mo.......

Discussion

La puissance élevée de neurotoxines botuliques et la facilité relative de leur armement a abouti à leur classification dans la catégorie A (priorité) les agents de bioterrorisme par les US Centers for Disease Control and Prevention. Malheureusement, il n'y a pas approuvé par la FDA thérapeutiques pour contrer BoNT intoxication après la toxine a été intériorisée par les neurones moteurs. Tout mécanisme druggable qui favorise la récupération neuronale de BoNT intoxication pourrait conduire à l'élaboration d'un.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurotoxine botulique A  ;	Metabiologics	NA	Sans numéro de catalogue
Plaques de microtitre	Greiner  ;	655946	Poly-D-Lysine 96-well plaques
BACs anticorps	Lampire Biological	NA
Microchem	National  ;	0255
Méthanol	Thermo Scientific	A412-20
Formaldéhyde	Thermo Scientific	28908
Sérum de cheval	Invitrogen	16050
PE JANUS MDT Mini poste de travail automatisé	Perkin Elmer	AJMDT01
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
BIII tubuline	anticorps R& D Systems	BAM1195
Tween 20	Sigma	P1379-1L
Hoechst 33342dye  ;	Invitrogen	3570
Anti-souris IgG	Invitrogen	A21236
Anti lapin IgG	Invitrogen	A10042
Columbus Logiciel d’analyse d’images	Perkin Elmer	Ver 2.4
Spotfire	Perkin Elmer	Ver 5.5
Clorox bleach	Fisher Scientific	18-861-284
Pile