Et høyt innhold Imaging Assay for Identifisering av botulinumneurotoksin hemmere
Summary
Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.
Abstract
Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.
Introduction
Bakterien Clostridium botulinum produserer botulinumneurotoksin, en av de mest potente biologiske giftene vi kjenner til ett. Det er 7 forskjellige Bont serotyper (Bont / AG). Bont / A-Gall indusere lammelse ved nevromuskulære krysset på grunn av Snare kompleks proteolyse 2,3. Snare proteolyse hindrer signalstoffet vesikkel-membran fusion og derfor blokker eksocytose av nevrotransmittere 4. Den spesifikke snare målet avhenger av det spesielle bont serotype involvert i rus prosessen. Bont / A og Bont / E cleave SNAP-25 mens Bont / C kløyver begge SNAP-25 og syntaxin 5. Den gjenværende serotyper henge fast synaptobrevin (også kalt Vesikkel-assosiert membranprotein (VAMP). Bont / A ble valgt for analyse utvikling som den er ansvarlig for en stor andel av naturlig forekommende botulisme og har den lengste varighet av virkning til 6. Utvikling av lite molekyl therapeutics mot Bont / A er et hovedmål forvår drug discovery-programmet og har benyttet tradisjonelle mål-baserte metoder for å identifisere aktive nettstedet proteolytiske hemmere 7, 8-10. Imidlertid vil etableringen av aktive nettstedet hemmere med bredspektret aktivitet mot flere serotyper og etter eksponering effekt trolig være utfordrende.
Vi har derfor iverksatt en innovativ, fenotypiske drug discovery tilnærming som bruker Bont SNAP-25 cleavage som en funksjonell endepunkt for å identifisere små molekyler som kan blokkere Bont-mediert motoriske nervecellen rus. SNAP-25 er nødvendig for neurotransmitterfrigivning, som nedbrytning av SNAP-25 er prediktive for lammelse og dødelighet in vivo. For eksempel kan celle-basert screening lede til oppdagelsen av nye modulatorer av cellulære faktorer som er ansvarlige for toksin inaktivering eller inhibering av toksin reaksjonsveier inne målrettede celler. En viktig faktor i fenotypiske assay utvikling er utvalget av fysiologisk relevante biologiske modeller. We og andre har beskrevet mus embryonale stamceller (ES) celle-stammer motoriske nevroner som rekapitulere den immunologiske karakter av primære motoriske nerveceller, blant annet uttrykk for SNAP-25 11- 13. Viktigere, disse mobilsystemer er svært følsomme for Bont / A rus og demonstrere doseavhengig spalting av SNAP-25 som svar på økende konsentrasjoner av toksin 11,12. De differensierte motoriske nerveceller er også produsert i mengder som er tilstrekkelig for høy gjennomstrømning plate basert analyse og tillatt utformingen av en rekke cellulære tester.
Den fenotypiske analysen er en immunfluorescens metode å benytte to forskjellige antistoffer å kvantifisere spalting av endogent uttrykt full lengde SNAP-25 under Bont / A forgiftning av mus motoriske nervecellen kultur. En karboksylterminal Bont / A cleavage følsomme (BACS) antistoff som gjenkjenner bare full lengde SNAP-25 gjør at vurderingen av Bont / A mediert proteolyse av SNAP-25uttrykk i mus motor nevroner 10. Et skjematisk diagram av HCI-analysen er vist i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den kraftige effekten av Botulinum nervegifter og det er relativt enkelt av deres weaponization har resultert i deres klassifisering som kategori A (høyest prioritet) biothreat agenter ved US Centers for Disease Control and Prevention. Dessverre er det ingen FDA godkjente therapeutics å motvirke Bont rus etter at toksinet har blitt internalisert av motoriske nerveceller. Enhver druggable mekanisme som fremmer neuronal utvinning fra Bont forgiftning kan føre til utvikling av en potensiell terapi for å beskytte både …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
References
- Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
- Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin. Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).
- Yersin, A., et al. Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).
- Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).
- Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense. Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).
- Nuss, J. E., et al. Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies. Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).
- Opsenica, I., et al. A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus. Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).
- Opsenica, I., et al. The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease. European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).
- Nuss, J. E., et al. Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease. ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem cell research. 6, 195-205 (2011).
- Pellett, S., et al. Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A. Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).
- Fischer, A., et al. Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).
