में माइलॉयड कोशिकाओं गतिशीलता की वास्तविक समय इमेजिंग<em> Apc<sup> न्यूनतम / +</sup</em> ट्यूमर आंतों डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी कताई द्वारा
Summary
By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Abstract
माइलॉयड कोशिकाओं ट्यूमर के भीतर सबसे प्रचुर मात्रा में प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं और ट्यूमर प्रगति को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है. आधुनिक intravital इमेजिंग तकनीक अंग अंदर रहते सेलुलर व्यवहार का प्रेक्षण सक्षम है लेकिन इस तरह के आंत के रूप में होने के कारण अंग और ट्यूमर पहुंच कैंसर के कुछ प्रकारों में चुनौतीपूर्ण हो सकता है. आंतों ट्यूमर का प्रत्यक्ष अवलोकन जैसा कि पहले बताया नहीं गया है. यहाँ वर्णित एक शल्य प्रक्रिया ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों और इंजेक्शन tracers या एंटीबॉडी का उपयोग करके जीवित चूहों में ट्यूमर आंतों के भीतर माइलॉयड सेल गतिशीलता का प्रत्यक्ष अवलोकन की अनुमति देता है. इस प्रयोजन के लिए तेजी से छवि अधिग्रहण के साथ लंबे समय तक निरंतर इमेजिंग की अनुमति देता है कि एक चार रंग, बहु क्षेत्र, सूक्ष्म lensed कताई डिस्क confocal खुर्दबीन इस्तेमाल किया गया है. पार कर रहे हैं छोटी आंत में कई adenomas कि विकसित Apc न्यूनतम / + चूहों माइलॉयड कोशिकाओं कल्पना करने के लिए C-FMS-EGFP चूहों के साथ और ACTB-ECFP चूहों के साथतहखाने की आंतों उपकला कोशिकाओं कल्पना करने के लिए. इस तरह के रक्त वाहिकाओं और neutrophils, और serosal सतह के माध्यम से इमेजिंग के लिए ट्यूमर स्थिति के लिए प्रक्रिया के रूप में विभिन्न ट्यूमर घटकों, लेबलिंग के लिए प्रक्रियाओं को भी वर्णित हैं. इमेजिंग के कई घंटे से संकलित समय चूक फिल्मों आंतों microenvironment में सीटू माइलॉयड सेल व्यवहार का विश्लेषण अनुमति देते हैं.
Introduction
भारी सबूत अब fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, प्रतिरक्षा और भड़काऊ कोशिकाओं, बाह्य मैट्रिक्स, और घुलनशील कारकों सहित विषम सेल आबादी, से मिलकर ट्यूमर microenvironment, लगभग सभी को योगदान करके दीक्षा और ठोस ट्यूमर की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि यह दर्शाता है कैंसर 1 की पहचान. दरअसल, ट्यूमर प्रगति के दौरान, दुष्टता 2 के लिए अनुकूल एक microenvironment उत्पन्न करने के लिए विकसित उस तब्दील कैंसर कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं के बीच निरंतर गतिशील बातचीत कर रहे हैं. ट्यूमर microenvironment घुसपैठ कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलावा, माइलॉयड कोशिकाओं 3 सबसे प्रचुर मात्रा में हैं. (टीएएम) ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज से मिलकर, माइलॉयड व्युत्पन्न दबानेवाला कोशिकाओं (MDSCs), वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) और neutrophils (PMNs), माइलॉयड कोशिकाओं अस्थि मज्जा से भर्ती कर रहे हैं और उत्तरोत्तर साइटोकिन्स, वृद्धि कारक है और proteases जो जारी करने, ट्यूमर घुसपैठ प्रचार कर सकते हैंट्यूमर के विकास और 4 फैल गया. कैंसर की कोशिकाओं और माइलॉयड कोशिकाओं के बीच crosstalk जटिल लेकिन गतिशील है. इस प्रकार उनकी बातचीत की प्रकृति को समझने के लिए इन कोशिकाओं के बजाय एक विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में भाग लेने के कैंसर की प्रगति को बढ़ावा देने के लिए क्यों निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और इसे नियंत्रित करने के लिए नए लक्ष्य को खोजने के लिए मदद मिल सकती है.
Intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्यक्ष अवलोकन लाइव चूहों 5 के ऊतकों के भीतर सेल गतिशीलता पर जानकारी प्रदान करता है. एक चार रंग, बहु क्षेत्र, सूक्ष्म lensed कताई डिस्क confocal प्रणाली स्तन ट्यूमर 6 भीतर stromal कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए डिजाइन किया गया था. यह दृष्टिकोण लंबे समय तक निरंतर इमेजिंग सक्षम बनाता है और इस तरह के प्रस्ताव कलाकृतियों को कम करने के लिए (एक) तेजी से छवियों अधिग्रहण, (ख) दीर्घकालिक संज्ञाहरण, (ग) विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का पालन करने के लिए चार रंग अधिग्रहण, (घ) फ्लोरोसेंट लेबलिंग के रूप में कई फायदे भी शामिल के विभिन्न tumoral घटक है, और विभिन्न ट्यूमर microenvironments बुद्धि (ई) अवलोकनएक ही माउस हिन माउस परिवर्तनशीलता 7-9 करने के लिए माउस से बचने के लिए. इस तकनीक के साथ, अलग सेल व्यवहार tumorigenesis के प्रगतिशील चरणों को प्रदर्शित करता है कि स्तन ट्यूमर वायरस (MMTV) प्रमोटर संचालित polyoma बीच टी ओंकोजीन (PyMT) मॉडल में सूचित किया गया है. (Foxp3 EGFP transgene द्वारा कल्पना Tregs,) रक्त वाहिकाओं के लिए निकटता में preferentially विस्थापित विनियामक टी लिम्फोसाइट DCS (CD11c-DTR-EGFP), कार्सिनोमा जुड़े fibroblasts (Fsp1 + / + -EGFP) और माइलॉयड कोशिकाओं (सी एफएमएस जबकि -EGFP) ट्यूमर जन के भीतर से ट्यूमर परिधि में उच्च गतिशीलता दिखा रहे हैं. तीव्र प्रणालीगत हाइपोक्सिया की हालत में, कोशिकाओं को अलग ढंग से चले गए: Tregs 6 स्थानांतरित करने के लिए जारी है कि माइलॉयड कोशिकाओं के विपरीत पलायन को रोकने के. इसके अलावा, एक ही माउस मॉडल में, यह ट्यूमर मंच के साथ कि डॉक्सोरूबिसिन संवेदनशीलता परिवर्तन दिखाया गया है, दवा वितरण दवा प्रतिक्रिया, और डॉक्सोरूबिसिन से संबंधित हैउपचार ट्यूमर के लिए माइलॉयड कोशिकाओं की CCR2 निर्भर भर्ती के लिए जाता है. इस प्रकार, लाइव इमेजिंग भी बगल में दवा प्रतिक्रियाओं में अंतर्दृष्टि और chemoresistance 10,11 के जीव विज्ञान को हासिल किया जा सकता है.
एडिनोमेटस पोली पोसिस कोलाई (APC) जीन उत्परिवर्तन आमतौर पर मानव कोलोरेक्टल adenomas और कार्सिनोमा 12 और पेट के कैंसर 13 के लिए एक अत्यंत उच्च जोखिम होंगी, जिसका पारिवारिक एडिनोमेटस पोली पोसिस (FAP), में APC जीन परिणाम की एक प्रति का उत्परिवर्तन में होते हैं. माउस तनाव Apc न्यूनतम / + APC जीन की कोडोन 850 पर एक ट्रंकेशन उत्परिवर्तन किया जाता है और अनायास सभी छोटी आंत 14 16 पर कई आंतों adenomas विकसित करता है. Peritoneal गुहा खोलने आंत तक पहुंच के लिए आवश्यक है के बाद से आंत का लंबे समय तक intravital इमेजिंग, क्योंकि प्रक्रिया के invasiveness की चुनौती दे रहा है. लघु अवधि के लाइव इमेजिंग सेंटudies पहले से स्वस्थ आंत 17,18 पर प्रकाशित किया गया है, लेकिन ट्यूमर आंतों की लंबी अवधि के प्रत्यक्ष अवलोकन सूचना नहीं गया है. एक शल्य प्रक्रिया पहले से छवि स्तन ट्यूमर 6,10 करने के लिए इस्तेमाल किया intravital कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग करते हुए, डिजाइन और आंत की serosal सतह के माध्यम से ट्यूमर कल्पना करने के लिए परिष्कृत किया गया है. इस पत्र में, एक प्रोटोकॉल एक Apc न्यूनतम / + चूहों का उपयोग करके छोटी आंत में ट्यूमर के भीतर माइलॉयड कोशिकाओं के व्यवहार का पालन करने की अनुमति देता है कि वर्णित है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में, एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेट की serosal ओर से imaged एक जीवित जानवर में कई घंटे के लिए ट्यूमर आंतों में माइलॉयड सेल गतिशीलता की डिस्क confocal इमेजिंग कताई के लिए वर्णित है.
सूजन से बचने के लिए और इष…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Apc न्यूनतम / + चूहों जीनोटाइपिंग के लिए यिंग यू धन्यवाद देना चाहूंगा. इस अध्ययन INSERM से धन और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान (CA057621 और AI053194) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
| Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088 (2013).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Walther, A., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Su, L. K., et al. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science. 256 (5057), 668-670 (1992).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy. J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).
- Haigis, K. M., et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Janssen, K. P., et al. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).
- Takaku, K., et al. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 92 (5), 645-656 (1998).
