における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージング<em>のApc<sup>最小/ +</sup</em>腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより
Summary
By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Abstract
骨髄細胞は、腫瘍内の最も豊富な免疫細胞であり、腫瘍の進行を促進することが示されている。現代の生体内イメージング技術は、臓器内部の生きた細胞挙動の観察を可能にするが、そのような腸などの臓器や腫瘍のアクセシビリティのためにいくつかのタイプの癌に挑戦することができます。腸腫瘍の直接観察は、以前に報告されていない。ここで説明する外科的処置は、トランスジェニック蛍光レポーターマウスおよび注射トレーサーまたは抗体を使用して生きたマウスにおける腸腫瘍内の骨髄細胞動態の直接観察を可能にする。この目的のために、迅速な画像取得との長期の連続撮影を可能にする四色、マルチリージョン、マイクロレンズ化スピニングディスク共焦点顕微鏡が用いられている。交差して小腸内の複数の腺腫を発症Apcの 最小 / +マウス骨髄細胞を可視化するには、c-FMS-EGFPマウスを用いたとACTB-ECFPマウスを用いた陰窩の腸上皮細胞を可視化した。そのような血管および好中球、および漿膜面を画像化するために、腫瘍を位置決めするための手順と異なる腫瘍の成分を標識するための手順も記載されている。イメージングの数時間からコンパイルタイムラプスムービーは、腸の微小環境におけるその場での骨髄細胞の挙動の分析を可能にする。
Introduction
圧倒的な証拠が、腫瘍の微小環境は、線維芽細胞、内皮細胞、免疫および炎症細胞、細胞外マトリックスおよび可溶性因子を含む不均一な細胞集団からなる、ほぼすべてのに寄与することによって、固形腫瘍の開始と進行に重要な役割を果たしていることを示している癌1の特徴。実際、腫瘍進行中に、悪性2に有利な微小環境を生成するために進化し、形質転換癌細胞と間質細胞との間の一定の動的相互作用が存在する。腫瘍微小環境に浸潤する免疫細胞の中では、骨髄細胞を3で最も豊富である。 （TAM）腫瘍関連マクロファージから成る、骨髄由来サプレッサー細胞（MDSCを）、樹状細胞（DC）及び好中球（PMN）、骨髄細胞は骨髄から動員されると次第にサイトカイン、増殖因子及びプロテアーゼ放出、腫瘍に浸潤する促進することができます腫瘍増殖および4を広げる。がん細胞および骨髄細胞間のクロストークが複雑で動的である。従って、それらの相互作用の性質を理解することは、これらの細胞ではなく、抗腫瘍免疫応答に関与する癌の進行を促進する理由を決定するために重要であり、それを制御するための新しい目標を発見するのに役立つ。
生体顕微鏡による直接観察が生きたマウス5の組織内細胞動態に関する情報を提供します。四色は、多領域は、マイクロレンズ付きスピニングディスク共焦点システムは、乳腺腫瘍6内の間質細胞を研究するために設計された。このアプローチは、長期の連続撮影を可能にし、そのような運動アーチファクトを最小化するためには、（a）迅速な画像の取得、（b）は、長期の麻酔、（c）は、異なる細胞型に追従する4色の取得、（d）の蛍光標識のようないくつかの利点を含む異なる腫瘍コンポーネント、および異なる腫瘍微小環境のウィットの（e）の観察マウス変動7-9にマウスを避けるために、同じマウスヒン。この技術により、異なる細胞行動が腫瘍形成の進行段階を表示する乳癌ウイルス（MMTV）プロモーター駆動オーマミドルT癌遺伝子（PyMT）モデルで報告されている。制御性Tリンパ球（Foxp3のEGFP導入遺伝子によって可視化Tregは、）のDC（CD11cの-DTR-EGFP）、癌関連線維芽細胞（FSP1 + / + -EGFP）および骨髄細胞（C-FMSのに対して、血管に近接して優先的に移行-EGFP）は、腫瘍塊内でよりも腫瘍周辺で高い運動性を示す。急性の全身性の低酸素状態において、細胞は、異なっ移行：Tregは6を移動し続ける骨髄細胞とは対照的に移行停止。また、同じマウスモデルでは、腫瘍段階とドキソルビシン感受性の変化を示したが、薬物分布は、薬物反応、およびドキソルビシンに関連している治療は、腫瘍への骨髄細胞のCCR2依存動員につながる。したがって、ライブイメージングはまた、その場および化学療法抵抗10,11の生物学における薬物応答への洞察を得るために使用することができる。
大腸腺腫様ポリポーシス（APC）遺伝子変異は、一般的にヒト結腸直腸腺腫および癌腫12および大腸癌13に非常に高いリスクを与える家族性大腸腺腫症（FAP）、中APC遺伝子結果の単一コピーの変異で起こる。マウス系統のApc 最小 / + は、APC 遺伝子のコドン850での切断変異を運び、自発的にすべての小腸14〜16を介して複数の腸腺腫を開発しています。腹膜腔を開くと、腸へのアクセスのために必要があるため、腸の長期生体内イメージングは、原因処置の侵襲性の挑戦である。短期ライブイメージングSTudiesは、以前に健康な腸17,18上で公開されているが、腸腫瘍の長期の直接観測が報告されていない。外科的処置は、以前に画像乳房腫瘍6,10に使用される生体スピニングディスク顕微鏡システムを使用して、腸の漿膜表面を介して腫瘍を可視化するために設計され、洗練されている。本論文では、プロトコルは、1 は 、APC 最小 / +マウスを使用することにより、小腸の腫瘍内の骨髄細胞の挙動に追従することを可能に記載されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、詳細なプロトコルは、腸の漿膜側から撮像生きた動物での数時間のために腸腫瘍における骨髄細胞動態のディスク共焦点画像を回転させる方法が記載されている。
炎症を避けるために、最適な生理学的条件を持つように、腸の画像化は、無傷の器官に行われなければならない。光が上皮に到達する前にそのような平滑筋などの異なる組織層を通過する必要?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは 、APC 最小/ +マウスのジェノタイピングのための英ゆうに感謝したいと思います。この研究は、INSERMと国立衛生研究所からの助成金（CA057621およびAI053194）からの資金によってサポートされていました。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
| Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
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