Realtid Mätningar av membranprotein: Receptor interaktioner Använda Surface Plasmon Resonance (SPR)
Summary
(Surface Plasmon Resonance, SPR) är en etikett-fri metod för att detektera biomolekylära interaktioner i realtid. Häri ett protokoll för ett membranprotein: är receptorinteraktion experiment beskrivs, medan de diskuterar för- och nackdelar med tekniken.
Abstract
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Introduction
Protein-proteininteraktioner (PPI); bildning och dissociation av proteinkomplex, är nyckelhändelser i många biologiska processer (t.ex. replikering, transkription, translation, signalering, cell-cell kommunikation). Semi-kvantitativa studier av PPI utförs ofta med hjälp av rullgardins eller immunfällningsförsök. Men dessa (och liknande) tekniker begränsad i intervallet tillhörighet som kan mätas (lågt mikromolära och högre affinitet) på grund av de tvättsteg som är förbundna med sådana tekniker. Sådana "end-point" tekniker kan inte identifiera gående eller låg affinitet interaktioner som ofta stora biologiska konsekvenser. Dessutom är den tidsmässiga upplösningen av sådana metoder ytterst begränsad, oftast storleksordningar lägre än de satser som reaktionen. SPR vinner dessa brister på grund av dess ökad känslighet och överlägsen temporal upplösning 1,2. SPR är en etikett-fri metod, och som sådanmolekylär interaktion kan mätas (så länge som de massändringar kan detekteras). Förutom PPI, har det i stor utsträckning använts för att karakterisera protein-ligand, protein-läkemedel (eller liten molekyl), protein-DNA och protein-RNA-interaktioner 3-5. Resultat registreras och ritas i realtid, vilket möjliggör snabb ändrade experimentella betingelser och flexibel experimentell design.
Den fysikaliska principen bakom SPR baserade instrument är användningen av ett optiskt system som mäter en förändring av brytningsindex på sensorytan vid massförändringar 2. En av de interagerande partners (härefter ligand) immobiliseras på en polymermatris chip och den andra molekylen (härefter analyt) bringas att strömma över ytan. Analyt bindning till liganden förändrar massan på spånytan. Denna massändring är direkt och proportionellt relaterat till förändringar i brytningsindex för ytan. Resultaten plottas i realtid ochpresenteras som responsenheter (RU) som en funktion av tiden. En sådan kurva benämns en Sensogram (t.ex. Figur 1). Sedan SPR följer den fullständiga tidsförloppet för interaktion, är pre-jämvikts kinetiska hastighetskonstanter härrör, förutom till jämvikt affiniteter. Enligt nedan, pre-jämvikts beteende ett givet system rymmer mycket information, och ger ett mycket annorlunda perspektiv än enbart jämvikt. När systemet är kalibrerat, experiment är mycket snabb och kräver endast små mängder protein material (mikrogram till nanogram belopp). Samla fullständig kinetisk information om ett givet system kan åstadkommas i dagar. Den höga känslighet SPR ger mätningar som inte är möjliga att använda någon annan teknik 6. Detta är dock hög känslighet en "tveeggat svärd", eftersom det kan vara en stor källa för falskt positiva data. Varje faktor som påverkar det reflekterande index registreras och plottas på Sensogrammet. Som sådan, apenliga kontroller måste användas för att eliminera falskt positiva, och stöd från kompletterande metoder är mycket rekommenderas.
Figur 1 illustrerar framskridandet av en SPR experimentet med hjälp av NTA-belagda sensorchipet. Sensogrammet i panel A visar injektion av nickeljoner över NTA matrisen (unsubtracted data), och paneler BD visa data efter avdrag signalen kommer från den negativa kontrollcellen. Röda och blå pilar visar insprutnings början och slut, respektive. Immobilisering av liganden på chipet gradvis förändrar massan tills injektionen är avslutad. Den stabila platå observeras efter avslutande av ligandens injektion speglar stabil association av liganden till ytan (Figur 1B, cykel 2). När en stabil baslinje uppnås en buffert injiceras under liganden och referenscellen (Figur 1B, cykel 3) .Detta injektion fungerar som en "tom kontroll", och kommer att varasubtraheras under analysen. Vid injektion, är mindre ändringar registreras, vilket återspeglar ett flöde av massa genom chipet. Sedan i en separat cykel (Figur 1B, cykel 4), är analyten injiceras; gradvis ökning av RU representerar analyten associering till liganden. De bindningsställen blir gradvis ockuperade dess att jämvikt uppnås. Så snart injektion slutar, en nedgång i RU speglar komplexets dissociation. Från sådana sensograms pre-jämvikts och jämviktskonstanter kan härledas (se senare). Figur 1 visar en transient växelverkan mellan liganden och analyten. När interaktionen är mer stabil, är nedgången i RU-nivå långsammare, vilket återspeglar en lägre k d.
Häri beskriver vi en SPR experiment som syftar till att karakterisera interaktionen mellan en membrantransportör (detergent solubiliserat) och dess funktionella partner, dess besläktade substratbindande protein 6,7. Den valda model-systemet är ett ATP-bindande kassett (ABC) transportör, ModBC-A i Archeaglobus fulgidus. Detta system valdes för sin mycket reproducerbara resultat, högt signalbrusförhållande, och klassisk "on / off" priser. Dessutom homologer ABC transportörer finns att tjäna som viktiga negativa kontroller. Transportören, ModBC (ligand A) extraheras från membranet med användning av tvättmedel, renas och immobiliseras på chipet. Dess lösligt samverkande partner, Moda, är analyten. Som en negativ kontroll-ligand, är en annan ABC-transport RbsBC används ("ligand B").
Protocol
Representative Results
Discussion
SPR är en mycket känslig metod för att studera molekylära interaktioner, och är ofta den enda metod som ger realtidsövervakning av transienta (men viktiga) interaktioner. Ett exempel är den övergående samverkan som presenteras häri, som inte kunde upptäckas genom någon annan metod (pull-down-analyser, liposomer sedimente 6 analyser). Dessutom medan andra metoder är begränsade till jämvikt mätningar (oavsett om kvantitativ eller kvalitativ), är SPR en av de enda tekniker som mäter även pre-j…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. . Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. . Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
