Real-time cytotoksicitetsassays i humant fuldblod
Summary
Helblodet cytotoksicitetsassay (WCA) er en cytotoksicitetsanalyse udviklet ved at inkorporere high-throughput celle positionering teknologi med fluorescensmikroskopi og automatiseret billedbehandling. Her beskriver vi, hvordan lymfom celler behandlet med et anti-CD20-antistof kan analyseres i realtid i humant fuldblod give kvantitative cellulær cytotoksicitet analyse.
Abstract
En levende celle-baserede fuldblod cytotoksicitetsassay (WCA), der giver adgang til tidsmæssig information af den samlede celle cytotoksicitet er udviklet med high-throughput celle positionering teknologi. De målrettede tumor cellepopulationer første forprogrammeret til immobilisering i et array format, og mærket med grønne fluorescerende cytosoliske farvestoffer. Efter Cellearray formation, er antistoflægemidler tilsat i kombination med humant fuldblod. Propidiumiodid (PI) tilsættes derefter til at vurdere celledød. Cellearray analyseres med en automatisk imaging system. Mens cytosolisk farvestof etiketter de målrettede tumorcellepopulationer, PI etiketter de døde tumorcellepopulationer. Således kan andelen af target cancercelledrab kvantificeres ved at beregne antallet af overlevende målrettede celler til antallet af døde målceller. Med denne metode, forskerne har adgang til tidsafhængig og dosisafhængig cellecytotoksicitet information. Bemærkelsesværdigt, ingen farlige radiokemikalier anvendes. Den WCA præsenteres her er blevet testet med lymfom, leukæmi, og cellelinjer fra solide tumorer. Derfor WCA giver forskerne til at vurdere drug effekt i et yderst relevant ex vivo tilstand.
Introduction
Nylige fremskridt inden for den farmaceutiske industri har ført til en øget interesse for at realisere de specifikke identifikationer af tumor celleantistoffer og personlige kræftbehandling; dog flere hindringer i processen. Kun 5% af stoffer, der har anticancer aktivitet i præklinisk udvikling er licenseret efter viser tilstrækkelig effekt i fase II-III-test 1,2. De prækliniske strategier (både in vitro og in vivo) er suboptimal så mange eksempler har vist, at antitumorlægemidler opfører sig anderledes i mennesker og i forsøgsdyr hovedsageligt på grund af deres forskellige blodkomponenter 3-5.
At afhjælpe behovet for en antitumor drug screening platform og til at tilvejebringe en check-punkt før bekostelig dyreforsøg og kliniske forsøg, foreslås et humant fuldblod cytotoksicitetsassay (WCA) til evaluering antitumorlægemiddel effekt i en mere relevant biologisk miljø. Denfuldblod cytotoksicitet assay kan anvendes til at vurdere virkningen af de enkelte celler til antistoffer og andre lægemiddelkandidater i humant fuldblod.
WCA er udviklet ved at inkorporere high-throughput celle positionering teknologi med høj kapacitet og høj indhold imaging 6. Ved anvendelse af et automatiseret billedbehandlingssystem, kan antallet af både levende og døde celler bestemmes med en høj grad af præcision. På grund af det faktum, at målceller immobiliseres på samme fokale plan, WCA er i stand til at give kvantitative cytotoksicitet analyse i realtid uden fjernelse af røde blodlegemer. Desuden automatiske imaging system giver flere fordele, såsom at kun målceller, der har nået de angivne kriterier (f.eks., Fluorescens-mærkede celler og celle morfologi) er indhegnet og forarbejdes. Det giver også mulighed for produktion af 144 plader pr dag. Derfor er dette imaging kapacitet og overførselshastighed muliggør drift af high-cIndholdsproduktion og højt gennemløb eksperimenter samtidigt. Ved at kombinere WCA og automatiseret billedbehandlingssystem kan opnås high throughput kvantitativ cellecytotoksicitet analyse inden for et mere biologisk relevant miljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
WCA er et kritisk in vitro-anti-cancer screening værktøj med enkelt celle resolution 12-16, ideelt udnyttet efter de traditionelle målgrupper screeninger, såsom CDC og ADCC assays 9-11, og før prækliniske dyreforsøg. I øjeblikket er det primære target screening assays, såsom CDC eller ADCC assays alle udført i en forenklet medier eller et puffersystem. Men lægemiddelkandidater, der viser effekten på disse forenklede puffersystem er ikke altid effektive i mere komplekse fuldblo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker National Cancer Institute IMAT program fra NIH for at finansiere dette arbejde [R33 CA174616-01A1].
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Name/Discription |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates–where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580 (2009).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).
