In vitro Syntes av modifierade mRNA för induktion av proteinuttryck i humana celler
Summary
I denna video artikeln beskriver vi syntesen av modifierade mRNA in vitro för induktion av proteinuttryck i celler.
Abstract
Den exogena leverans av kodning syntetisk budbärar-RNA (mRNA) för induktion av proteinsyntes i önskade celler har en enorm potential inom regenerativ medicin, grundläggande cellbiologi, behandling av sjukdomar, och omprogrammering av celler. Här beskriver vi en steg för steg-protokoll för alstring av modifierade mRNA med nedsatt immunaktivering potential och ökad stabilitet, kvalitetskontroll av producerat mRNA, transfektion av celler med mRNA och verifiering av den inducerade proteinexpression med flödescytometri. Upp till 3 dagar efter en enda transfektion med eGFP mRNA, de transfekterade HEK293 celler producerar eGFP. I denna video artikeln, är syntesen av eGFP mRNA beskrivs som ett exempel. Däremot kan förfarandet tillämpas för tillverkning av andra önskade mRNA. Med användning av den syntetiska modifierade mRNA kan celler induceras att transient uttrycka de önskade proteinerna, som de normalt inte skulle uttrycka.
Introduction
I celler, transkriptionen av budbärar-RNA (mRNA) och följande translation av mRNA till önskade proteiner säkerställa en väl fungerande celler. Ärftliga eller förvärvade genetiska sjukdomar kan leda till otillräcklig och dysfunktionella syntes av proteiner och orsaka allvarliga sjukdomar. Således, en ny terapeutisk strategi för att inducera produktionen av saknade eller defekta proteinerna är den exogena leverans av syntetiskt modifierat mRNA i celler, som kodar för det önskade proteinet. Därigenom celler aktiveras för att syntetisera funktionella proteiner, vilket de normalt inte kan producera eller skulle naturligtvis inte behöver. Genom att använda denna metod, kan genetiska sjukdomar korrigeras genom införande av mRNA som kodar för defekta eller saknas protein 1. MRNA Terapi kan också användas för vaccination för att syntetisera proteinantigener, som uttrycks av tumörceller eller patogener. Därigenom kan värdens immunsystem aktiveras för att effektivt eliminera tumörceller eller förhindra infesfunktione r 2,3. Dessutom, under de senaste åren, mRNA med framgång för att generera inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). För detta ändamål har fibroblaster transfekterade med mRNA för att inducera uttryck av omprogrammering faktorer 4-6 och omvandla dem i iPSCs med en enorm potential inom regenerativ medicin.
Tidigare användning av konventionella mRNA förknippad med låg stabilitet och stark immunogenicitet. Således var kliniska tillämpningar av konventionella mRNA begränsad. Men byte av cytidin och uridin med 5-metylcytidin och pseudouridine inom mRNA-molekylen från Kariko och kollegor gjort mRNA-molekyler stabila i biologiska vätskor och dramatiskt minskad immunaktivering 7-10, som nu gör den kliniska tillämpningen av modifierade mRNA.
Använda syntetiskt framställda modifierade mRNA, kan önskade gentranskript tillfälligt levereras in vivo 11eller in vitro för att inducera proteinexpression. Den introducerade mRNA översätts under fysiologiska förhållanden av det cellulära översättningen maskiner. På grund av bristande integration i värdcellens genom jämförelse med virala genterapivektorer, är risken för onkogenesen förhindras 12,13. Således kommer terapi med modifierad syntetisk mRNA få bättre klinisk acceptans i framtiden.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för framställning av modifierat mRNA (Figur 1), transfektion av celler med mRNA och utvärdering av proteinuttryck i transfekterade celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
MRNA-behandling har en enorm potential inom området regenerativ medicin, behandling av sjukdomar och vaccination. I denna video visar vi framställning av en stabiliserad, modifierat mRNA för induktion av proteinuttryck i celler. Med hjälp av detta protokoll, kan andra önskade mRNA genereras. In vitro-syntes av modifierade mRNA tillåter transfektion av celler med önskade mRNA för att inducera uttryck av målproteiner. Därigenom är det önskade proteinet uttryckas transient under fysiologiska betingelse…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet har finansierats av Europeiska socialfonden i Baden-Württemberg, Tyskland.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202, 100 µl: 022491237, 1000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g l-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g l-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5`)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) with reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| 0.5-10 kb RNA Ladder | Invitrogen | 15623-200 | |
| 1x TBE buffer | |||
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3´ | |
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3´ | |
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss |
References
- Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
- Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).
- Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
- Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).
