In vitro-syntese af modificeret mRNA for Induktion af protein-ekspression i humane celler
Summary
I denne video artiklen beskriver vi in vitro syntese af modificerede mRNA for induktion af proteinekspression i cellerne.
Abstract
Den exogene levering af kodning syntetisk messenger RNA (mRNA) for induktion af proteinsyntese i ønskede celler har et enormt potentiale inden for regenerativ medicin, grundlæggende cellebiologi, behandling af sygdomme og omprogrammering af celler. Her beskriver vi en trinvis protokol for generering af modificeret mRNA med nedsat immun aktivering potentiale og øget stabilitet, kvalitetskontrol af produceret mRNA, transfektion af celler med mRNA og verifikation af den inducerede protein-ekspression ved flowcytometri. Op til 3 dage efter en enkelt transfektion med eGFP mRNA, de transficerede HEK293-celler producerer eGFP. I denne video artiklen, er syntesen af eGFP mRNA beskrevet som et eksempel. Imidlertid kan fremgangsmåden anvendes til fremstilling af andre ønskede mRNA. Anvendelse af det syntetiske modificerede mRNA kan celler induceres til transient at udtrykke de ønskede proteiner, som de normalt ikke ville udtrykke.
Introduction
I celler, transkriptionen af messenger-RNA (mRNA) og følgende translation af mRNA til ønskede proteiner sikre en korrekt funktion af celler. Arvelige eller erhvervede genetiske sygdomme kan føre til utilstrækkelig og dysfunktionelle syntese af proteiner og forårsage alvorlige sygdomme. Således er en ny terapeutisk fremgangsmåde til at inducere produktion af manglende eller defekte proteiner er det exogene levering af syntetisk modificeret mRNA i celler, som koder for det ønskede protein. Derved celler udløst at syntetisere funktionelle proteiner, som de normalt ikke kan producere eller ville naturligvis ikke brug for. Med denne fremgangsmåde kan genetiske sygdomme korrigeres ved indføring af mRNA, der koder for det defekte eller manglende protein 1. MRNA terapi kan også anvendes til vaccination at syntetisere protein-antigener, som udtrykkes af tumorceller eller patogener. Derved kan værtens immunsystem aktiveres til effektivt at fjerne tumorceller eller forhindre infeKTIONER 2,3. Endvidere i de senere år blev mRNA med held anvendt til at generere inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). Til dette formål blev fibroblaster transficeret med mRNA'er at inducere ekspressionen af omprogrammering faktorer 4-6 og omsætte dem i iPSCs med et enormt potentiale i regenerativ medicin.
Tidligere var brugen af konventionelle mRNA forbundet med lav stabilitet og stærk immunogenicitet. Således blev kliniske anvendelser af konventionelle mRNA'er begrænset. Men udskiftning af cytidin og uridin med 5-methylcytidin og pseudouridine inden mRNA-molekylet ved Kariko og kolleger gjorde mRNA molekyler stabile i biologiske væsker og dramatisk reduceret immunaktivering 7-10, som nu giver mulighed for den kliniske anvendelighed af modificerede mRNA'er.
Ved hjælp af syntetisk fremstillede modificerede mRNA'er kan ønskede gentranskripter midlertidigt leveres in vivo 11eller in vitro at inducere proteinekspression. Den indførte mRNA translateres under fysiologiske betingelser af den cellulære translation maskineri. På grund af manglende integration i værtscellegenomet i forhold til virale genterapivektorer, er risikoen for onkogenese forhindret 12,13. Således vil behandling med modificeret syntetisk mRNA få bedre klinisk accept i fremtiden.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til fremstilling af modificerede mRNA (figur 1) transfektion af celler med mRNA og evaluering af protein-ekspression i transficerede celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
MRNA terapi har et enormt potentiale inden for regenerativ medicin, behandling af sygdomme og vaccination. I denne video viser vi, fremstilling af en stabiliseret, modificeret mRNA for induktion af proteinekspression i cellerne. Anvendelse af denne protokol, kan andre ønskede mRNA genereres. In vitro syntese af modificerede mRNA giver transfektion af celler med ønskede mRNA'er at inducere ekspression af målproteiner. Derved er det ønskede protein udtrykkes forbigående under fysiologiske betingelser, in…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev finansieret af Den Europæiske Socialfond i Baden-Wuerttemberg, Tyskland.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202, 100 µl: 022491237, 1000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g l-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g l-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5`)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) with reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| 0.5-10 kb RNA Ladder | Invitrogen | 15623-200 | |
| 1x TBE buffer | |||
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3´ | |
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3´ | |
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss |
References
- Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
- Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).
- Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
- Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).
