במאמר זה וידאו, אנו מתארים את הסינתזה במבחנה של mRNA שונה לזירוז של ביטוי חלבון בתאים.
המשלוח אקסוגני של קידוד RNA שליח סינטטי (mRNA) לזירוז סינתזה של חלבונים בתאים רצויים יש פוטנציאל עצום בתחומים של רפואת רגנרטיבית, ביולוגיה של תא בסיסי, טיפול במחלות, ותכנות מחדש של תאים. כאן, אנו מתארים צעד אחר צעד פרוטוקול לדור של mRNA שונה עם פוטנציאל מופחת חיסוני הפעלה ויציבות מוגברת, בקרת איכות של ה- mRNA מיוצר, transfection של תאים עם mRNA ואימות של ביטוי חלבון הנגרם על ידי זרימת cytometry. עד 3 ימים לאחר transfection יחיד עם eGFP mRNA, HEK293 תאי transfected לייצר eGFP. במאמר זה וידאו, הסינתזה של eGFP mRNA מתוארת כדוגמא. עם זאת, ההליך יכול להיות מיושם לייצור של ה- mRNA הרצוי האחר. שימוש בסינטטי שונה mRNA, יכולים להיגרם תאים לבטא את החלבונים הרצויים, שבו הם בדרך כלל לא מביעים זמניים.
בתאים, השעתוק של RNA שליח (mRNA) והתרגום הבא של ה- mRNA לחלבונים רצויים להבטיח את התפקוד התקין של תאים. הפרעות גנטיות תורשתיות או נרכשות יכולות להוביל לסינתזה מספיקה ולא מתפקדת של חלבונים וגורמות למחלות קשות. כך, גישה טיפולית חדשה ללעורר את הייצור של חלבונים חסרים או פגומים הוא המשלוח אקסוגני של סינטטי שונה mRNA לתאים, שקודים לחלבון הרצוי. וכך, תאים מופעלים לסנתז חלבונים פונקציונליים, שבו הם בדרך כלל לא יכולים לייצר או באופן טבעי לא צריכים. שימוש בגישה זו, ניתן לתקן הפרעות גנטיות על ידי הקדמה של mRNA שמקודד לחלבון הפגום או חסר 1. גם טיפול mRNA יכול לשמש לחיסון לאנטיגנים synthetize חלבון, אשר באים לידי ביטוי על ידי תאי גידול או פתוגנים. ובכך, מערכת חיסונית מארח יכולה להיות מופעלת כדי לחסל ביעילות תאים סרטניים או למנוע infections 2,3. יתר על כן, בשנים האחרונות, mRNA היה בהצלחה המשמש לייצור תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs). לצורך כך, fibroblasts היה transfected עם mRNAs לגרום הביטוי של תכנות מחדש גורמי 4-6 ולהמיר אותם בiPSCs עם פוטנציאל עצום ברפואת רגנרטיבית.
בעבר, השימוש בmRNA הקונבנציונלי היה קשור ביציבות נמוכה וחיסוני חזקים. כך, יישומים קליניים של mRNAs הקונבנציונלי היו מוגבלים. עם זאת, החלפת cytidine וuridine על ידי 5-methylcytidine וpseudouridine בתוך מולקולת mRNA על ידי Kariko ועמיתים שניתנו מולקולות mRNA יציבים בנוזלים ביולוגיים והפחתה דרמטית בהפעלת מערכת חיסונית 7-10, אשר כעת מאפשרת יישום הקליני של mRNAs שונה.
באמצעות מיוצר באופן סינטטי mRNAs שונה, תמלילי גן רצויים יכולים להיות מועברים באופן זמני בvivo 11או במבחנה כדי לגרום לביטוי חלבון. MRNA הציג מתורגם בתנאים פיסיולוגיים על ידי מכונות תרגום הסלולריות. בשל חוסר האינטגרציה לתוך הגנום של התא הפונדקאי לעומת וקטורי ריפוי גנטי נגיפיים, הסיכון של oncogenesis נמנע 12,13. כך, טיפול באמצעות mRNA הסינתטי שונה יקבל קבלה קלינית טובה יותר בעתיד.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לייצור של ה- mRNA שונה, transfection של תאים עם mRNA וההערכה של ביטוי חלבון בתאי transfected (איור 1).
יש טיפול mRNA פוטנציאל עצום בתחום של רפואת רגנרטיבית, טיפול במחלות וחיסונים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הייצור של ה- mRNA התייצב, שונה לזירוז של ביטוי חלבון בתאים. שימוש בפרוטוקול זה, יכול להיות שנוצר mRNA הרצוי אחר. הסינתזה במבחנה של mRNA שונה מאפשרת transfection של תאים עם mRN…
The authors have nothing to disclose.
פרויקט זה מומן על ידי קרנות החברתיות האירופיות באדן-וירטמברג, גרמניה.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cell culture | |||
DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
FBS | Life Technologies | 10500 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
Consumables | |||
Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202, 100 µl: 022491237, 1000 µl: 022491253 | |
Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
Plasmid amplification and purification | |||
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g l-1 in sterile water. |
LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g l-1 in sterile water. |
Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
mRNA production | |||
HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5`)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
Transfection | |||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) with reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
Gel electrophoresis | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
0.5-10 kb RNA Ladder | Invitrogen | 15623-200 | |
1x TBE buffer | |||
Flow cytometry analyses | |||
CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3´ | |
Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3´ | |
Equipment | |||
Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
CASY cell counter | Schärfe System | ||
Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
Bacterial incubator | Incutec | ||
Water bath | |||
ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
PCR thermocycler | Eppendorf | ||
Microcentrifuge | Eppendorf | ||
Vortex | peqlab | ||
Thermomixer | Eppendorf | ||
Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
Gel documentation system | Bio-Rad | ||
FACScan System | BD Biosciences | ||
Fluorescence microscope | Nikon | ||
Phase-contrast microscope | Zeiss |