Síntesis in vitro de ARNm modificado para la inducción de la expresión proteica en las células humanas
Summary
En este artículo de vídeo, se describe la síntesis in vitro del ARNm modificado para la inducción de la expresión de proteínas en las células.
Abstract
El suministro exógeno de codificación de ARN mensajero sintético (ARNm) para la inducción de la síntesis de proteínas en las células deseadas tiene un enorme potencial en los campos de la medicina regenerativa, la biología celular básica, el tratamiento de las enfermedades, y la reprogramación de las células. Aquí, se describe un paso a paso para la generación de protocolo de ARNm modificado con un reducido potencial de activación inmune y una mayor estabilidad, control de calidad de ARNm producido, la transfección de células con el ARNm y la verificación de la expresión de la proteína inducida por citometría de flujo. Hasta 3 días después de una sola transfección con eGFP ARNm, las células HEK293 transfectadas producen eGFP. En este artículo de vídeo, la síntesis de mRNA eGFP se describe como un ejemplo. Sin embargo, el procedimiento se puede aplicar para la producción de otros ARNm deseadas. Usando el ARNm sintético modificado, las células pueden ser inducidas a expresar transitoriamente las proteínas deseadas, que normalmente no expresarían.
Introduction
En las células, la transcripción de ARN mensajero (ARNm) y la siguiente traducción del ARNm en proteínas deseadas garantizar el correcto funcionamiento de las células. Trastornos genéticos hereditarios o adquiridos pueden conducir a la síntesis insuficiente y disfuncional de las proteínas y causar enfermedades graves. Por lo tanto, un nuevo enfoque terapéutico para inducir la producción de proteínas que faltan o defectuosos es la entrega exógena de sintético modificado ARNm en las células, que codifica la proteína deseada. De esta manera, las células se activan para sintetizar proteínas funcionales, que normalmente no pueden producir o, naturalmente, no necesitar. Usando este enfoque, trastornos genéticos pueden ser corregidos mediante la introducción de ARNm que codifica para la proteína defectuosa o faltante 1. La terapia de mRNA también se puede utilizar para la vacunación de sintetizar los antígenos de proteínas, que se expresan por las células tumorales o patógenos. De esta manera, el sistema inmune del huésped puede ser activado para eliminar eficazmente las células tumorales o prevenir infecciones 2,3. Además, en los últimos años, el ARNm se utilizó con éxito para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Para este propósito, los fibroblastos fueron transfectadas con ARNm para inducir la expresión de factores de reprogramación 4-6 y convertirlos en CMPI con un enorme potencial en medicina regenerativa.
Anteriormente, el uso de ARNm convencional se asoció con una baja estabilidad y fuerte inmunogenicidad. Por lo tanto, las aplicaciones clínicas de los ARNm convencionales eran limitadas. Sin embargo, la sustitución de citidina y uridina por 5-metilcitidina y pseudouridine dentro de la molécula de ARNm por Kariko y sus colegas rindió moléculas de ARNm estables en fluidos biológicos y redujo drásticamente la activación inmune 7-10, que ahora permite la aplicabilidad clínica de mRNAs modificados.
Uso de mRNAs modificados producidos sintéticamente, transcripciones de genes deseados se pueden entregar temporalmente en vivo 11o in vitro para inducir la expresión de la proteína. El ARNm introducido se traduce en condiciones fisiológicas por la maquinaria de traducción celular. Debido a la falta de integración en el genoma de la célula huésped en comparación con los vectores de terapia génica viral, el riesgo de oncogénesis se evita 12,13. Por lo tanto, la terapia usando ARNm sintético modificado va a mejorar la aceptación clínica en el futuro.
Aquí se describe un protocolo detallado para la producción de ARNm modificado (Figura 1), la transfección de células con ARNm y la evaluación de la expresión de la proteína en las células transfectadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La terapia de ARNm tiene un enorme potencial en el campo de la medicina regenerativa, el tratamiento de las enfermedades y la vacunación. En este vídeo, se demuestra la producción de un ARNm modificado estabilizada para la inducción de la expresión de proteínas en las células. El uso de este protocolo, otros ARNm deseadas se pueden generar. La síntesis in vitro de ARNm modificado permite la transfección de células con mRNAs deseados para inducir la expresión de proteínas diana. De este modo, la prot…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por el Fondo Social Europeo, en Baden-Württemberg, Alemania.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202, 100 µl: 022491237, 1000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g l-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g l-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5`)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) with reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| 0.5-10 kb RNA Ladder | Invitrogen | 15623-200 | |
| 1x TBE buffer | |||
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3´ | |
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3´ | |
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss |
References
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