Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler<em> ° C. elegans</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
C. elegans epidermis ve manikür yaralama kaynaklanan lokalize hasarı onarmak basit ama sofistike deri tabakası oluşturur. Bu modelde, yara cevaplarını ve onarım çalışmaları sitoskeletal ve doku hasarına genomik yanıtların anlamamıza ışıklı var. En sık kullanılan iki yöntemler C. yara elegans yetişkin deri mikroenjeksiyon iğneler, ve yerel laserler ile azabı vardır. Yerel yaralama İğne manikür, epidermis ve ilişkili dışı matriks bozan ve aynı zamanda iç dokularına zarar verebilir. Daha lokalize hasara lazer ışınlama ile sonuçlanır. Yaralama yüksek epidermal Ca 2+ (saniye-dakika), oluşumu ve yara yerinde (1-2 saat), antimikrobiyal peptit genlerin yüksek transkripsiyon bir aktin içeren halkanın kapatılması da dahil olmak üzere kolayca tahlil tepkilerin bir arkaya (2-24 tetikler saat), ve skar oluşumu. Esasen bütün vahşi tip yetişkin hayvanlar, nerede yaralama hayattayara onarımı veya diğer cevaplar kusurlu mutantlar olarak hayatta kalma azalma göstermektedir. Detaylı iğne ve lazer yaraladığı protokoller ve kantitatif ve yara tepkiler ve onarım süreçleri (Ca dinamikleri, aktin dinamikleri, antimikrobiyal peptit indüksiyon ve hayatta kalma) görselleştirme için testler sunulmaktadır.
Introduction
Cilt yara iyileşmesi mekanizmaları temel biyolojik ilgi ve insan sağlığına uygun. Omurgalılar ve memelilerde yara iyileşmesi düzenli yanıt birçok dokuda ve 1 sinyal karmaşık bir dizi ihtiva eder. Birçok basit bir genetik model organizmalar da cilt yaraları 2 şifa yeteneğine sahiptir. Bu cilt yara onarım genetik uysal modellerini analiz nedenle ilgi olduğunu. Biz ve diğerleri cilt yara için yeni model 3,4 şifa olarak Caenorhabditis elegans kullanmaya başlamışlardır. Bu protokolün amacı C kullanmak için araştırmacıların geniş bir dizi sağlamaktır bir araç olarak elegans epidermal yara iyileşmesinin moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak.
C. elegans cilt (ayrıca hipodermiste olarak da bilinir) epidermis ve dışı manikür 5 içermektedir. Yetişkin Epidermis büyük sinsityum k olan çok çekirdekli sinsitiyumların az sayıda oluşturulmaktadırnown olarak hyp7. Epidermis kendi apikal yüzeyinde manikür salgılar basit epitel olduğunu. Cilt aktif cilt-delici patojenlere karşı savunmak ve küçük yaralar 4 onarabilir. C yara onarımı elegans cilt tüm vahşi tip hayvanların iğne veya lazer radyasyonun sebep olduğu lokal deri hasarı nedeniyle küçük delici yaraları hayatta hayatta neredeyse, sağlamdır. C elegans cilt yaralama epidermal doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, yara kapama ve skar oluşumu 4 olmak üzere tepkilerin bir paketi, tetikler. Yetişkin Epidermis post-mitotik ve yara iyileşmesi, epidermal proliferasyonu veya hücre göçü karşı lokal hücresel yanıtları içerir. O cilt yaralanma membran TRPM kanal GTL-2 ve iç Ca 2 + mağaza 3 gerektiren, Ca 2 + epidermal büyük ve devamlı bir artış tetikler göstermiştir. Epidermal Ca 2 + sinyal F-aktin halkalarının oluşumuna ve kapatma wo için gerekli olanund sitesi. Yaralama ayrıca nlp-29 gibi amper transkripsiyonunu aktive doğuştan gelen bağışıklık yanıtları uyarır. amper yaralama kaynaklı transkripsiyon, bir TIR-1 epidermis 4 özerk hareket / PMK-1 p38 MAP kinaz kaskad bağlıdır. Ya Ca 2 + sinyal yolu ya da doğuştan gelen bağışıklık yanıtının kusurlar düşük sağkalım sonrası yaralama yol açacaktır. C nispeten basit bir yapı elegans epidermis, in vivo görüntüleme için genetik tractability ve avantajları yara onarım birden yönlerini incelemek için o mükemmel bir sistem yapmak.
Iğne yaralama ve lazer yaralama: Burada yaralama iki ortak yöntemleri için protokolleri sunuyoruz. İğne yaralama (iğne çektirmenin dışında) hiçbir özel ekipman gerektirir ve tecrübesi ile günde solucanlar yüzlerce yapılabilir. İğne yaralanma agar plakaları üzerinde büyüyen hayvanlar üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bunun aksine, lazer yaralama Anes gerçekleştiriliranestezisi sağlanır hayvanlar bir lamel altında ped agar üzerine monte edilmiş ve hasara karşı hücresel yanıtların canlı görüntüleme için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
iğne ve lazer yaraladığı Burada sunulan yöntemler hasarı onarmak için epidermal epitel yeteneğini değerlendirmek için tamamlayıcı yaklaşımlar sağlamak. Iğne yaralama epidermis, manikür, ve büyük olasılıkla iç bodrum zarlarını bozan ise Lazer yaralama, epidermise sınırlı olabilir nispeten lokalize ve (lazer konfigürasyonuna bağlı olarak) 'dir. İğne yaralama daha doğru patojenlerin veya doğal ortamda mekanik hasar sebebiyle ortaya çıkan yaraların benzeyebilir. Bir kural olarak, iğ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).
- Xu, S., Chisholm, A. D. A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans. Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr Biol. 18, 481-489 (2008).
- Chisholm, A. D., Xu, S. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology. 48, 225-250 .
- Pujol, N., et al. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, (2008).
- Tong, A., et al. Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).
- Zugasti, O., Ewbank, J. J. Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis. Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).
- Zhao, X., et al. Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo. Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).
- Jansson, H. B. Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants. J Nematol. 26, 430-435 (1994).
- Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans. Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).
- Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation. J Vis Exp. (42), (2010).
- Hashmi, S., et al. Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures. BioTechniques. 19, 766-770 (1995).
