Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in<em> C. elegans</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
Die C. elegans Epidermis und Cuticula bilden eine einfache, aber anspruchsvolle Hautschicht, die lokalisierte Schäden durch Verwundung was zu reparieren. Untersuchungen der Wunde Antworten und Reparatur in diesem Modell haben unser Verständnis des Zytoskeletts und genomische Reaktionen auf Gewebeschäden beleuchtet. Die beiden am häufigsten verwendeten Verfahren, um die C gewickelt elegans erwachsenen Haut sticht mit Mikroinjektionsnadeln und lokale Laserbestrahlung. Nadel lokal Verwundung stört die Kutikula, Epidermis und der extrazellulären Matrix assoziiert und können auch innere Gewebe beschädigen. Laserbestrahlung führt zu mehr lokalisiert Schaden. Verwundung löst eine Reihe von leicht getestet Antworten einschließlich erhöhter epidermaler Ca 2+ (Sekunden-min), die Bildung und die Sperrung eines aktinhaltigen Ring an der Wundstelle (1-2 h), erhöhte Transkription des antimikrobiellen Peptids Gene (2-24 h) und die Narbenbildung. Im Wesentlichen alle erwachsenen Tiere Wildtyp überleben Verwundung, woMutanten in der Wundheilung oder andere Reaktionen defekt zeigen verringerte Überleben. Detaillierte Protokolle für die Nadel und Laser Verwundung und Assays zur Quantifizierung und Visualisierung von Wundantworten und Reparaturprozesse (Ca Dynamik Aktindynamik, antimikrobielles Peptid Induktion und Überlebensrate) dargestellt.
Introduction
Wundheilung der Haut Mechanismen der biologischen Grundlagen Interesse und relevant für die menschliche Gesundheit. Wundheilung in Wirbeltieren und Säugetieren umfaßt eine komplexe Reihe von koordinierten Antworten von mehreren Geweben und Signalisierungs 1. Viele einfache genetische Modellorganismen sind auch fähig, Heilung von Hautwunden 2. Es ist daher von Interesse, genetisch manipulierbaren Modelle der Haut die Wundheilung zu untersuchen. Wir und andere haben damit begonnen, Caenorhabditis elegans Verwendung als neues Modell für die Haut Wundheilung 3,4. Ziel dieses Protokolls ist es, eine breitere Gruppe von Forschern, C. nutzen zu können elegans als Werkzeug zur molekularen und zellulären Mechanismen der epidermalen Wundheilung zu untersuchen.
Die C. elegans Haut besteht aus der Epidermis (auch als Unterhaut bekannt) und die extrazelluläre Schuppenschicht 5. Die erwachsenen Epidermis ist aus einer kleinen Anzahl von mehrkernigen Syncytien, von denen der größte der Syncytium k gebildetnown als hyp7. Die Epidermis ist ein einfaches Epithel, das die Nagelhaut auf ihrer apikalen Oberfläche absondert. Die Haut kann aktiv gegen die Haut eindringenden Krankheitserreger zu verteidigen und zu reparieren kleine Wunden 4. Wundreparatur des C. elegans Haut ist robust, da fast alle Wildtyp-Tiere überleben können kleine Stichverletzungen durch Nadeln oder lokale Hautschäden durch Laserbestrahlung verursacht überleben. C. elegans Haut Verwundung löst eine Reihe von Reaktionen, einschließlich einer epidermalen angeborenen Immunantwort, Wundverschluss und die Narbenbildung 4. Die erwachsenen Epidermis ist postmitotischen und Wundheilung umfasst lokale Zellreaktionen im Gegensatz zu epidermalen Proliferation oder Zellmigration. Wir haben gezeigt, dass Haut Verwundung löst einen starken und nachhaltigen Anstieg der epidermalen Ca 2+, erfordern die Membran TRPM Kanal GTL-2 und der internen Ca 2+ Geschäfte 3. Für Bildung und Schließung von F-Actin Ringe an der wo ist der epidermale Ca 2+ Signal erforderlichund Ort. Verwundung induziert auch angeborene Immunantworten, die die Transkription AMPs wie NLP-29 zu aktivieren. Die Verwundung induzierten Transkription AMPs ist abhängig von einer TIR-1 / PMK-1 p38 MAP-Kinase-Kaskade wirkt sich autonom in der Epidermis 4. Defekte entweder in der Ca 2+ Signalweg oder in der angeborenen Immunantwort zu niedrigeren Überleben nach der Verwundung führen. Der relativ einfache Aufbau der C. elegans Epidermis, seine genetische Lenkbarkeit und Vorteile für die in-vivo-Bildgebung machen es ein ausgezeichnetes System, um mehrere Aspekte der Wundheilung zu untersuchen.
Hier präsentieren wir Protokolle für die beiden häufigsten Methoden der Verwundung: needle Verwundung und Laser Verwundung. Needle Verwundung erfordert keine spezielle Ausrüstung (mit Ausnahme der Nadel puller) und mit der Erfahrung kann auf Hunderte von Würmern pro Tag durchgeführt werden. Needle Verwundung auf Tiere wachsen auf Agar-Platten durchgeführt. Im Gegensatz dazu wird die Laser Verwundung auf anes geführtthetized Tieren montiert auf Agar-Pads unter einem Deckglas, und ist für die Live-Darstellung der zellulären Reaktionen auf Schäden geeignet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Nadel und Laser Verwundung hier dargestellten Verfahren stellen komplementäre Ansätze, um die Fähigkeit des Epidermisepithel um Schäden zu reparieren. Laser Verwundung relativ lokalisierte und (je nach Laserkonfiguration) kann auf die Epidermis beschränkt werden, wobei nadel Verwundung stört die Epidermis, Kutikula und wahrscheinlich interne Basalmembranen. Needle Verwundung kann genauer ähneln Wunden, die durch Krankheitserreger oder mechanische Schäden in der natürlichen Umwelt zugefügt hat. In der Regel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).
- Xu, S., Chisholm, A. D. A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans. Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr Biol. 18, 481-489 (2008).
- Chisholm, A. D., Xu, S. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology. 48, 225-250 .
- Pujol, N., et al. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, (2008).
- Tong, A., et al. Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).
- Zugasti, O., Ewbank, J. J. Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis. Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).
- Zhao, X., et al. Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo. Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).
- Jansson, H. B. Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants. J Nematol. 26, 430-435 (1994).
- Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans. Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).
- Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation. J Vis Exp. (42), (2010).
- Hashmi, S., et al. Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures. BioTechniques. 19, 766-770 (1995).
