La peau adulte de C. elegans est un modèle traitable pour l’étude des réponses épithéliales des plaies, y compris la fermeture de la plaie, la formation de cicatrices et l’immunité innée.
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Article de méthode
Méthodes pour Blessant Peau et Essais pour les réponses de blessure dans C. elegans
Dans cet article
Résumé
Résumé
La C. elegans cuticule épiderme et forment une couche de la peau simple mais sophistiqué qui permet de réparer des dommages localisés résultant de blessant. Études des réponses de la plaie et la réparation de ce modèle ont éclairé notre compréhension du cytosquelette et les réponses génomiques à des lésions tissulaires. Les deux méthodes les plus couramment utilisés pour blesser l'C. elegans peau adulte sont piqûres avec aiguilles de microinjection, et irradiation laser local. Needle blessant localement perturbe la cuticule, épiderme, et de la matrice extracellulaire associé, et peut également endommager les tissus internes. les résultats d'irradiation laser dans des dommages plus localisée. Blessure déclenche une succession de réponses facilement dosés y compris épidermique élevée de Ca2 + (secondes) minutes, la formation et la fermeture d'un cycle contenant de l'actine au niveau du site de la plaie (1-2 heures), la transcription de gènes élevée de peptides antimicrobiens (24/2 h), et la formation de cicatrices. Essentiellement tous les animaux adultes de type sauvage survivent blessure, oùque des mutants défectueux dans la réparation de la plaie ou d'autres réponses montrent diminution de la survie. Des protocoles détaillés pour l'aiguille et blessures laser, et des dosages pour la quantification et la visualisation des réponses plaies et les processus de réparation (dynamique Ca, dynamique de l'actine, antimicrobien peptide induction et la survie) sont présentés.
Introduction
mécanismes de guérison des plaies de la peau sont d'intérêt biologique fondamentale et pertinente pour la santé humaine. La cicatrisation des plaies chez les vertébrés et les mammifères comprend une série complexe de réponses coordonnées de multiples tissus et de signalisation 1. De nombreux organismes modèles génétiques simples sont également capables de cicatrisation des plaies de la peau 2. Il est donc intéressant d'analyser les modèles génétiquement traitables de plaie cutanée réparation. Nous et d'autres avons commencé à utiliser Caenorhabditis elegans comme nouveau modèle de plaie cutanée guérison 3,4. L'....
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Protocole
Les protocoles suivants décrivent la procédure détaillée pour C. elegans blessant la peau et pour tester les réponses des plaies.
1. Aiguille Blessant 3,4
- Cultivez vers unstarved sains sur NGM norme (milieu de croissance des nématodes) Plaques avec E. bactéries coli OP50 que l'alimentation, maintenues dans un incubateur à 20 °.
NOTE: Méthodes de NGM plaques d'agar et de culture de routine de C. elegans peut être trouvé à www.wormbook.org 6. - Choisissez 25 vers de stade L4 à un fraîchement ensemencées plaque 1 jour avant blessant et de la culture à....
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Résultats
Laser ou une aiguille blessure va déclencher l'élévation rapide et soutenue des niveaux Ca épidermiques, comme visualisé avec des capteurs Ca tels que GCaMPs (Figure 1). L'élévation Ca se produit en quelques secondes, et reste élevé pendant plusieurs dizaines de minutes. Aiguille blessant reproductible conduit à la formation d'anneaux F-actine dans des sites de la plaie (figure 2); ceux-ci apparaissent en quelques minutes, et peu à peu étroit sur 1-2 heures après la blessure. anneaux d'.......
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Discussion
Les méthodes présentées ici pour aiguille et blessures laser offrent des approches complémentaires pour évaluer la capacité de l'épithélium épidermique pour réparer les dégâts. Laser blessure est relativement localisée et (selon la configuration de laser) peut être limitée à l'épiderme, tandis que l'aiguille blessure perturbe l'épiderme, la cuticule, et susceptibles membranes basales internes. Needle blessure peut ressembler plus précisément blessures infligées par des agents pathogènes ou des dommages m.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne sont pas au courant d’intérêts concurrents.
Remerciements
Les méthodes de blessure à l’aiguille pour C. elegans ont été développées pour la première fois par Nathalie Pujol et Jonathan Ewbank ; nous remercions Nathalie Pujol pour les commentaires sur le manuscrit. Les travaux de notre laboratoire sur la réparation des plaies épidermiques de C. elegans sont soutenus par une subvention du NIH à A.D.C. (R01 GM054657).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plaque de Pétri en plastique | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Verre borosilicate capillaire | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Extracteur d’aiguille | Sutter Instrument ; | P-2000 | |
| Pic à vis sans fin (fil de platine) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Maison | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O à 1 litre. Stériliser par autoclave | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Utilisation 500 ml pour 50 vers |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| Machine PCR | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| Tubes PCR 96 puits | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Logiciel d’analyse d’images | Dispositifs moléculaires | Metamorph |
Références
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol<....
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Réimpressions et autorisations
